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1、本章內(nèi)容： 種子制備原理與技術(shù) 影響種子質(zhì)量的因素 種子質(zhì)量的控制措施 種子制備的放大原理與技術(shù) 種子制備原理與技術(shù) 優(yōu)良種子應(yīng)具備的條件 生長活力強(qiáng)，延遲期短； 生理狀態(tài)穩(wěn)定； 濃度及總量能滿足發(fā)酵罐接種量的要求； 無雜菌污染 ， 保證純種發(fā)酵； 適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)能力穩(wěn)定 種子罐級數(shù)的確定 種子擴(kuò)大的級數(shù)：制備種子需逐級擴(kuò) 大培養(yǎng)的次數(shù) 級數(shù)愈少 ， 愈利于簡化工藝及控制 ， 并可減少種子罐污染雜菌的機(jī)會 ， 減 少消毒及值班工作量 ， 減少因種子罐 生長異常而造成的發(fā)酵波動 。 確定方法 菌種的性質(zhì) (如菌種傳代后的穩(wěn)定性 ) 瓶中的孢子數(shù) ， 孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度 發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最
2、低接種量 種子罐與發(fā)酵罐的容積比 生產(chǎn)規(guī)模 隨工藝條件的改變作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整 種子質(zhì)量的判斷方法 通常檢測的培養(yǎng)液中參數(shù) pH是否在種子要求的范圍之內(nèi) 糖、氨基氮、磷酸鹽的含量 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀 有無雜菌污染 其他參數(shù)，如接種前酶活、種子罐的 溶氧和尾氣等 種子制備 步驟： 斜面培養(yǎng)基中活化； 扁瓶固體培養(yǎng)基或搖瓶培養(yǎng)基中擴(kuò)大培 養(yǎng)，完成實(shí)驗(yàn)室種子制備 一級種子罐，制備生產(chǎn)用種子；視情況 確定擴(kuò)大級數(shù)，完成生產(chǎn)車間種子制備； 種子轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐 種子制備過程 實(shí)驗(yàn)室種子制備階段：瓊脂斜面至 固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)（如茄子瓶斜 面培養(yǎng)等或液體搖瓶培養(yǎng) 生產(chǎn)車間種子制備階段：種子罐擴(kuò) 大培養(yǎng)
3、實(shí)驗(yàn)室種子制備 無菌方式接保藏的菌種至斜面培養(yǎng)基上，成 熟后挑選正常菌落至試管斜面和搖瓶。 菌種產(chǎn)孢子能力強(qiáng)及孢子發(fā)芽、生長繁殖迅 速，可用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子 菌種產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢，可用搖 瓶液體培養(yǎng)法 不產(chǎn)孢子的菌種，保藏基礎(chǔ)上，在一定溫度 下活化即可 種子擴(kuò)大培養(yǎng)階段 液體培養(yǎng)法：液體試管、三角瓶搖床 振蕩或回旋式培養(yǎng)。 表面培養(yǎng)法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盤 培養(yǎng)。 固體培養(yǎng)法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏 瓶、培養(yǎng)皿等麩皮培養(yǎng)。 生產(chǎn)車間種子制備 實(shí)驗(yàn)室制備的孢子斜面或搖瓶種子移接到種子 罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 種子罐培養(yǎng)一獲得足夠的菌種數(shù)量，二 種子 罐的培養(yǎng)基接近發(fā)酵罐培養(yǎng)的醪液成分和培養(yǎng) 條
4、件，使菌體適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境 種子罐級數(shù)越少，越有利于簡化工藝和控制， 并減少由于多次轉(zhuǎn)種而帶來的染菌機(jī)會以及 減少因種子罐生長異常而造成的發(fā)酵波動 但考慮能否在一定時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)、足量的 種子以滿足發(fā)酵的需求 種齡與接種量 接種齡 種子罐中培養(yǎng)的菌體從開始移入下一級種 子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間 種子培養(yǎng)期應(yīng)取菌種的對數(shù)生長期為宜， 菌種過嫩或過老，不但延長發(fā)酵周期，而 且會降低產(chǎn)量。 大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點(diǎn)： 縮短生長過程的延緩期，因而縮短了 發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率 節(jié)約發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗 有利于減少染菌機(jī)會 放射形土壤桿菌多糖（ ARPS） 發(fā)酵過程中不同的接種齡對多糖產(chǎn)量的影響 接
5、種種齡和接種量 接種量：移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液 體的體積的比例 接種量過多，菌絲生長過快、溶氧不足，衰 老細(xì)胞增加等，發(fā)酵后勁不足 種量過少延長發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而 且易造成染菌。 以生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據(jù) 接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。 在放射形土壤桿菌多糖（ ARPS） 發(fā)酵過程中不同的接種量對多糖產(chǎn)量的影響 影響種子質(zhì)量的因素 原材料質(zhì)量 培養(yǎng)溫度 濕度 通氣與攪拌 斜面冷藏時(shí)間 培養(yǎng)基 pH 原材料質(zhì)量 原材料質(zhì)量波動引起種子質(zhì)量不穩(wěn)定 原材料質(zhì)量波動的主要原因：無機(jī)離子 含量不同（微量元素 Mg2+、 Cu2+、 Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少
6、 也會影響孢子的質(zhì)量）。 培養(yǎng)溫度 溫度過低，菌種生長發(fā)育緩慢 溫度過高會使菌絲過早自溶 在制備土霉素生產(chǎn)種子過程中，高于 37 培養(yǎng)時(shí)， 孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨 基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)降低等現(xiàn)象。 濕度 濕度低，孢子生長快； 濕度大，孢子生長慢 制備土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子時(shí) 發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下 部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速 蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少 通氣與攪拌 足夠的通氣量，以保證菌種代謝正 常，提高種子的質(zhì)量 攪拌可提高通氣效果，促進(jìn)生長繁 殖，過度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡， 液膜表面的酶易氧化變性，泡沫過 多增加染菌機(jī)會，增加能耗。
7、 絲狀微生物不宜劇烈攪拌。 斜面冷藏時(shí)間 對孢子的生產(chǎn)能力有較大影響 冷藏時(shí)間越長，生產(chǎn)能力下降越多 鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6 冷藏兩 個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月的降低 18， 比冷藏 3個(gè)月的降低 35。 培養(yǎng)基 培養(yǎng)種子的目的： 擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量； 同時(shí)也必須培養(yǎng)出強(qiáng)壯、健康、活性 高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進(jìn)行分裂 或菌絲快速生長。 有較完全和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，糖分少，需充足 氮源和生長因子，無機(jī)氮源比例大； 各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高； 供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源； 應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近 。 種子培養(yǎng)基特點(diǎn) pH 選擇最適種子培養(yǎng) pH的
8、原則是獲得 最大比生長速率和適當(dāng)?shù)木?培養(yǎng)最后一級種子的培養(yǎng)基的 pH應(yīng) 接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH，以便種子 能盡快適應(yīng)新的環(huán)境 種子質(zhì)量的控制措施 菌種穩(wěn)定性的檢查 測定其生產(chǎn)能力，從中挑選高產(chǎn)菌株，并 及時(shí)對退化菌種進(jìn)行復(fù)壯 提供適宜的生長環(huán)境 種子無雜菌檢查，保證純種發(fā)酵。 種子液生化分析項(xiàng)目主要有：營養(yǎng)基質(zhì)的消 耗速度、 pH變化、溶氧變化、色澤和氣味等 種子制備的放大原理與技術(shù) 細(xì)菌發(fā)酵時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)； 細(xì)菌發(fā)酵過程中種子擴(kuò)大培養(yǎng)的主要目的是 為了獲得大量的活力強(qiáng)的種子 ； 種齡對于生芽孢的種子尤其重要。若接種物 含大量芽孢，將給后續(xù)發(fā)酵帶來較長遲滯期 梭狀芽孢桿菌發(fā)酵丁醇丙酮時(shí)
9、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的程序 舉 例： 酵母發(fā)酵時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng) 釀酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng) 最初采用純種進(jìn)行酵母發(fā)酵并設(shè)計(jì)出 酵母繁殖流程，他將每一步的接種量 規(guī)定為 10，并控制繁殖條件與釀造 時(shí)一致 現(xiàn)代的流程中，接種量為 1%或更低， 控制的條件也與釀造時(shí)不同。 面包酵母時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)的程序 絲狀真菌發(fā)酵的種子擴(kuò)大培養(yǎng) 絲狀真菌既可以利用孢子，也可以 利用菌絲體作為接種物接種到發(fā)酵罐 進(jìn)行發(fā)酵 在固化的培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子 “ 滾瓶 ” 技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)黃青霉的孢子生產(chǎn) 在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子 在谷類的顆粒表面形成大量的孢子 在液體深層培養(yǎng)基中產(chǎn)生孢子 利用孢子作為接種物 灰黃霉素產(chǎn)生菌展青霉一試驗(yàn)表明在良好的 通氣條件下，培養(yǎng)基中含氮是在 0.05 0.1 （ w/v）之間時(shí)，可以產(chǎn)生大量的孢子 絲狀真菌的菌絲體作為接種物 不能產(chǎn)生無性孢子的用繁殖體菌絲作 為接種物，如生產(chǎn)赤霉素的菌種 藤倉赤霉 問題：難以獲得均一的接種物 接種前將菌絲打成碎片，形成大量的 菌絲段，它具有大量的生長點(diǎn) 放線菌發(fā)酵時(shí)的種子擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)，制備孢子懸浮液作初級 種子 可用培養(yǎng)搖瓶菌絲體作為初級種子
發(fā)酵工程第五章發(fā)酵工業(yè)種子制備
