DNA重組技術(shù)的基本步驟【技術(shù)專攻】

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1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1專業(yè)課程u目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定u目的基因的獲取目的基因的獲取u基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建u將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2專業(yè)課程1 1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，它是它是RNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位

2、，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終止能終止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄3專業(yè)課程RNARNA聚合酶聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的一種能夠識(shí)別啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)的一種蛋白質(zhì)蛋白質(zhì).RNA RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，轉(zhuǎn)錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動(dòng)，并分子移動(dòng)，并以以DNADNA分子的一條鏈為模板合成分子的一條鏈為模板合成RNARNA。

3、轉(zhuǎn)錄完畢后，轉(zhuǎn)錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來(lái)，緊接著鏈釋放出來(lái)，緊接著RNARNA聚聚合酶也從合酶也從DNADNA模板鏈上脫落下來(lái)。模板鏈上脫落下來(lái)。4專業(yè)課程不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列苷酸序列.包括啟動(dòng)子和終止子包括啟動(dòng)子和終止子5專業(yè)課程2.2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子

4、外顯子 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNAmRNA前體前體加工加工翻譯翻譯肽鏈肽鏈啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子成熟成熟mRNAmRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序列。能夠編碼蛋白質(zhì)的序列。不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列。不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列。外顯子外顯子:內(nèi)含子內(nèi)含子:6專業(yè)課程真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。非編碼序列：非編碼序列：包

5、括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子7專業(yè)課程原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的3 3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思思考考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼非編碼8專業(yè)課程1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、獲取目的基因的方法有哪些？其操

6、、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過(guò)程分別是怎樣的？作過(guò)程分別是怎樣的？請(qǐng)閱讀請(qǐng)閱讀P9P9第一和二第一和二兩段兩段9專業(yè)課程10專業(yè)課程、從、從基因文庫(kù)基因文庫(kù)中獲取目的基因中獲取目的基因基因文庫(kù)基因文庫(kù) 基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文部分基因文庫(kù)庫(kù)11專業(yè)課程基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程限制酶限制酶拼接到載體上拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增 將含有某種生將含有某種生物不同基因的許物不同基因的許多多DNADNA片斷片斷,導(dǎo)入導(dǎo)入到到中中,各個(gè)受體菌各個(gè)受體菌分別含有這種生分別含有這種生物的不同基因物的不同基因,稱為基因文庫(kù)。稱為基因文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)基因組文庫(kù)12專業(yè)課程

7、cDNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建-反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使成的信使RNARNA為模板，為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNADNA，然后在酶的作用，然后在酶的作用下合成雙鏈下合成雙鏈DNADNA，從而，從而獲得所需的基因。獲得所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNADNA(目的基因目的基因)基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程13專業(yè)課程 真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？與原基因相同嗎？有哪些差異？原核

8、生物基因呢？原核生物基因呢？思考？思考？14專業(yè)課程基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù)文庫(kù))比較比較15專業(yè)課程怎樣從基因文庫(kù)中得到我怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢們所需的目的基因呢?16專業(yè)課程依據(jù)依據(jù)-目的基因的有關(guān)信息。目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。17專業(yè)課程構(gòu)建基因組構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的文庫(kù)時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的A、染色體、染

9、色體DNA B、線粒體、線粒體DNAC、總、總mRNA D、tRNA 目的基因可從基因文庫(kù)中獲得，下列有關(guān)基因文庫(kù)的目的基因可從基因文庫(kù)中獲得，下列有關(guān)基因文庫(kù)的描述正確的是描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù)、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù)B、將含有某種生物不同的許多、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個(gè)生片段，導(dǎo)入某個(gè)生物物 體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù)體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù)C、含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)、含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫、含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫cDNA文

10、文庫(kù)庫(kù)AC18專業(yè)課程PCRPCR的全稱：的全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRPCR的原理：的原理：DNADNA復(fù)制復(fù)制 PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提條件：的前提條件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。選修選修3、P5819專業(yè)課程模板模板原料原料引物引物 酶酶控制溫度控制溫度利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù)擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因目的基因目的基因DNADNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸如單鏈如單鏈DNADNA分子片段，使分子片段，使DNADNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的3 3端開始連端開始連接脫氧核苷酸接脫氧核苷酸耐熱的

11、耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR儀自動(dòng)調(diào)控儀自動(dòng)調(diào)控PCRPCR的條件：的條件：20專業(yè)課程21專業(yè)課程過(guò)程：過(guò)程：a a、DNADNA變性變性（90-9590-95）：）：雙鏈雙鏈DNADNA模板在熱作用下，模板在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：）：系統(tǒng)溫度降低，系統(tǒng)溫度降低，引物引物與與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成與模的作用下，合成與模板互補(bǔ)的板互補(bǔ)的_。氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈d.重復(fù)重復(fù)a.

12、b.ca.b.c步驟：每重復(fù)一步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一22專業(yè)課程1.加熱至加熱至95攝氏度的目的是使攝氏度的目的是使DNA中的中的 斷裂，這一過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)斷裂，這一過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò) 的的作用來(lái)完成的。作用來(lái)完成的。2.當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板末端結(jié)合，在當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板末端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成后合成2個(gè)個(gè)DNA分子，此過(guò)程中的原料分子，此過(guò)程中的原料 是是 ，遵循的原則是，遵循的原則是 。3.Taq酶的特點(diǎn)是（酶的特點(diǎn)是（）A.耐強(qiáng)酸耐強(qiáng)酸 B.耐強(qiáng)堿耐強(qiáng)堿 C.耐高溫耐高溫

13、D.最適溫度最適溫度37攝氏度攝氏度4.請(qǐng)指出請(qǐng)指出PCR技術(shù)與技術(shù)與DNA復(fù)制過(guò)程的區(qū)別復(fù)制過(guò)程的區(qū)別 解旋酶解旋酶C脫氧核苷酸脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則23專業(yè)課程DNA復(fù)制復(fù)制PCR技術(shù)技術(shù)場(chǎng)所場(chǎng)所原理原理?xiàng)l件條件解旋方式解旋方式酶酶特點(diǎn)特點(diǎn)結(jié)果結(jié)果PCR技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模四種脫氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、四種脫氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、半保留復(fù)制、邊解

14、旋變復(fù)制邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制全解旋再?gòu)?fù)制體外復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的大量的DNA片段片段形成整個(gè)形成整個(gè)DNA分子分子熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA連接酶等連接酶等24專業(yè)課程條件：條件：基因基因較小較小，核苷酸序列，核苷酸序列已知已知。蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè) 化學(xué)法合成的目化學(xué)法合成的目的基因含的基因含內(nèi)含子、啟內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子動(dòng)子和終止子嗎

15、？嗎？25專業(yè)課程反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化學(xué)合成法化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列肽鏈氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成人工合成法（人工合成法（真核生物真核生物）推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)單鏈單鏈DNADNA合成合成26專業(yè)課程2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫(kù)中提取從基因組文庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取從受體細(xì)胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A.B

16、.B.C.C.D.D.1在已知在已知基因的核苷酸基因的核苷酸序列的情況下，獲取目的序列的情況下，獲取目的基因的最方便方法是基因的最方便方法是A、化學(xué)合成法、化學(xué)合成法 B、基因組文庫(kù)法、基因組文庫(kù)法 C、CDNA文庫(kù)法文庫(kù)法 D、聚合酶鏈反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)27專業(yè)課程3 3、在基因工程中，把選出的一個(gè)目的基因（共在基因工程中，把選出的一個(gè)目的基因（共10001000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460460個(gè)）放入個(gè)）放入DNADNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4 4次，那么，在擴(kuò)增次，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是（儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫

17、氧核苷酸的個(gè)數(shù)是（）個(gè)）個(gè)A.540 B.8100 C.17280 D.756028專業(yè)課程4 4、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNADNA分分子片段為子片段為ATGTGATGTGTACACTACAC，要使其數(shù)量增多，可用，要使其數(shù)量增多，可用PCRPCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是 雙鏈雙鏈DNADNA分子為模板分子為模板 ATGTGATGTG或或TACACTACAC模板鏈模板鏈 四四種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 四種核苷酸四種核苷酸 DNADNA聚合酶聚合酶 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶引物聚合酶引

18、物 溫度變化溫度變化 恒溫恒溫A A B BC C D DD5、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因 利用利用PCR技術(shù)技術(shù)擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法 通過(guò)通過(guò)DNA合成儀利合成儀利用化學(xué)方法人工合成用化學(xué)方法人工合成A B C DD29專業(yè)課程（1 1）用一定的）用一定的_切切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出露出_。（2 2）用）用_ _ _切斷切斷目的基因，使其產(chǎn)生目的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。（3 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的）將切下的目的基因片段插入質(zhì)

19、粒的_處，再加入適量處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同1.1.過(guò)程過(guò)程:30專業(yè)課程質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶表表達(dá)達(dá)載載體體同一種同一種31專業(yè)課程2 2、基因表達(dá)載體的組成、基因表達(dá)載體的組成目的基因目的基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子:終止子終止子:標(biāo)記基因等標(biāo)記基因等一段有特殊結(jié)構(gòu)的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片

20、段片段。位于基因的首端。位于基因的首端。一段有特殊結(jié)構(gòu)的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段片段。位于基因的尾端。位于基因的尾端。32專業(yè)課程啟動(dòng)子的作用：?jiǎn)?dòng)子的作用：終止子作用：終止子作用：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。標(biāo)記基因作用：標(biāo)記基因作用：是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基 因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，如青霉素基因。如青霉素基因。是是RNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。，最終獲得蛋白質(zhì)

21、。33專業(yè)課程3 3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：a.a.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。并且可以遺傳給下一代。b.b.使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。思考：思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？什么？34專業(yè)課程不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止

22、子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼文庫(kù)獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增

23、強(qiáng)子等；他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。35專業(yè)課程載體載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNADNA片段。表達(dá)載體在載體片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)分結(jié)構(gòu)用到的

24、工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意注意36專業(yè)課程 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合所需的條件有目的基因與運(yùn)載體結(jié)合所需的條件有 同一種限制酶同一種限制酶 具有抗性基因的質(zhì)粒具有抗性基因的質(zhì)粒 RNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DN

25、A連接酶連接酶 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 ATP A BC D（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括 A目的基因目的基因 B啟動(dòng)子啟動(dòng)子 C終止子終止子 D標(biāo)記基因標(biāo)記基因ABCDD37專業(yè)課程下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是是A啟動(dòng)子是與啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼的部位，是起始密碼B啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因

26、從而便于篩選有目的基因從而便于篩選D基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別入方式不同而有所差別A38專業(yè)課程 1 1、什么是轉(zhuǎn)化？、什么是轉(zhuǎn)化？2 2、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是什么？具體過(guò)程是怎樣的？是什么？具體過(guò)程是怎樣的？3 3、目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法、目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？是什么？基本操作程序是怎樣的？4 4、目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是怎、目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？樣的？鈣離子有什么作用？39專業(yè)課程轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因目的基因進(jìn)入

27、進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)維持穩(wěn)定和表達(dá)的的過(guò)程。過(guò)程。40專業(yè)課程1.1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法常用的方法:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、基因槍法、花粉管通道法農(nóng)桿菌的特點(diǎn)農(nóng)桿菌的特點(diǎn):c.Tic.Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的并整合到受體細(xì)胞染色體的DNADNA上。上。b.b.具有趨化性。具有趨化性。a.a.易感染雙子葉植物和祼子植物。易感染雙子葉植物和祼子植物。41專業(yè)課程42專業(yè)課程整合整合到染色體上到染色體上轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至受

28、體細(xì)胞至受體細(xì)胞43專業(yè)課程 根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理，你能分析出農(nóng)桿菌不子葉植物的機(jī)理，你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？若想將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物若想將一個(gè)抗病基因?qū)雴巫尤~植物(如小麥），從理論上說(shuō)，你認(rèn)為應(yīng)該如小麥），從理論上說(shuō)，你認(rèn)為應(yīng)該怎么做？怎么做？P15-2因?yàn)閱巫尤~植物不能分泌出大量的酚類化合物來(lái)吸引農(nóng)桿菌，向單子葉植物的傷口處噴灑酚類化合物，使用基因槍法及花粉管道法。44專業(yè)課程 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)

29、力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。1、常用于單子葉、常用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法植物的轉(zhuǎn)化方法2、特點(diǎn)：成本高、特點(diǎn)：成本高45專業(yè)課程 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞

30、。因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。46專業(yè)課程.目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法常用的方法:顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)操作程序：操作程序：a.a.先提純含目的基因的表達(dá)載體先提純含目的基因的表達(dá)載體 b.b.從雌性動(dòng)物體內(nèi)取出卵（受精卵）從雌性動(dòng)物體內(nèi)取出卵（受精卵）c.c.顯微注射儀進(jìn)行顯微注射顯微注射儀進(jìn)行顯微注射 d.d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或?qū)⒑康幕虻氖芫岩浦驳捷斅压芑蜃訉m中發(fā)育成新個(gè)體子宮中發(fā)育成新個(gè)體47專業(yè)課程常用法：常用法：CaCa2+2+處理處理常用菌：常用菌：大腸桿菌大腸桿菌3.3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原

31、核生物的特點(diǎn)原核生物的特點(diǎn):繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。48專業(yè)課程大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過(guò)程大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過(guò)程:用用CaCa2+2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)重組表達(dá)載體載體DNADNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合分子與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收DNADNA分子。分子。增加細(xì)胞壁的透性，增加細(xì)胞壁的透性，與細(xì)胞膜無(wú)關(guān)與細(xì)胞膜無(wú)關(guān)49專業(yè)課程 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法2.2.將目的基因

32、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)3.3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理處理50專業(yè)課程植物基因植物基因工程工程動(dòng)物基因動(dòng)物基因工程工程微生物基微生物基因工程因工程常用方法常用方法受體細(xì)胞受體細(xì)胞比較目的基因?qū)氩煌?xì)胞的方法比較目的基因?qū)氩煌?xì)胞的方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法化法顯微注顯微注射法射法Ca2+處處理法理法體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵受精卵原核細(xì)胞原核細(xì)胞51專業(yè)課程1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是為受體細(xì)胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便 B繁殖

33、速度快繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單 D性狀穩(wěn)定、變異少性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細(xì)胞有、基因工程常用的受體細(xì)胞有 大腸桿菌大腸桿菌 枯草桿菌枯草桿菌 支原體支原體 動(dòng)植物細(xì)胞動(dòng)植物細(xì)胞A B C DBD52專業(yè)課程1 1、導(dǎo)入目的基因后需要檢測(cè)哪些方面？、導(dǎo)入目的基因后需要檢測(cè)哪些方面？各采取什么方法？各采取什么方法？2 2、什么是、什么是DNADNA分子探針？檢測(cè)時(shí)的分子探針？檢測(cè)時(shí)的DNADNA探探針通過(guò)什么原理來(lái)檢測(cè)目的基因和相針通過(guò)什么原理來(lái)檢測(cè)目的基因和相應(yīng)的應(yīng)的mRNAmRNA？3 3、利用抗體抗原雜交檢測(cè)的原理是什、利用抗體抗原雜交檢測(cè)的原理

34、是什么？么？53專業(yè)課程檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)方法檢測(cè)方法1.1.目的基因是否插入受目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體的體細(xì)胞染色體的DNADNA上上2.2.目的基因是否轉(zhuǎn)錄出目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA3.3.目的基因是否翻譯出目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)4 4、個(gè)體生物學(xué)水平的鑒、個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定定分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)抗原抗原抗體雜交抗體雜交DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)抗蟲鑒定、抗病鑒抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等定、活性鑒定等DNADNA探針：探針：用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基因的因的DNADNA片段。片段。54專業(yè)課程（一）、檢

35、測(cè)（一）、檢測(cè)1 1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 (關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟).首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作標(biāo)記等作標(biāo)記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯若顯示出雜交帶示出雜交帶,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子雜交分子雜交（2）過(guò)程）過(guò)程:55專業(yè)課程DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩

36、種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P P1515思考與探究思考與探究56專業(yè)課程57專業(yè)課程（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2 2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA3 3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)、檢測(cè)目的基

37、因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法:分子雜交法分子雜交法方法方法:抗原抗體雜交抗原抗體雜交過(guò)程過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA58專業(yè)課程目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)鑒定和檢測(cè)才能知和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)鑒定和檢測(cè)才能知道。下列屬于目的基因檢測(cè)和鑒定的是道。下列屬于目的基因檢測(cè)和鑒定的是檢測(cè)受體細(xì)胞中是否有目的基因檢測(cè)受體細(xì)胞中是否有目的基因 檢測(cè)受

38、檢測(cè)受體細(xì)胞中是否有致病基因體細(xì)胞中是否有致病基因 檢測(cè)目的基因是否檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出轉(zhuǎn)錄出mRNA 檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)質(zhì) A B C D59專業(yè)課程2、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C60專業(yè)課程歸納:基因工程的基本操作程序1.1.獲取目的基因獲取目的基因u 從基因文庫(kù)從基因文庫(kù)u 利用利用PCRPCRu 化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成2.2.構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體u 目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理處理4.4.目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定u 檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u 鑒定：鑒定：61專業(yè)課程