《味精的生產(chǎn)工藝》PPT課件.ppt

味精的制作 一 實驗?zāi)康?1掌握谷氨酸發(fā)酵的原理及發(fā)酵過程的控制和操作 2掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌的基本技術(shù)、谷氨酸菌種制備及種 子擴(kuò)大培養(yǎng)。 3了解用等電法從發(fā)酵液回收谷氨酸的方法。 4掌握由谷氨酸制備谷氨酸鈉的方法。 二 實驗原理 味精 ,也稱味素 ,因味精起源于小麥 ,俗稱 麩酸鈉、谷氨酸鈉 （分 子式 C5H8NO4Na ）。 谷氨酸是由谷氨酸棒桿菌以葡萄糖為原料生 產(chǎn)的一種呈味氨基酸，其代謝機理為：葡萄糖經(jīng)糖酵解（ EMP） 和單磷酸己糖途徑（ HMP）生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脫 羧生成乙酰 CoA，另一方面經(jīng) CO2固定作用生成草酰乙酸，兩 者合成檸檬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)（ TCA循環(huán)），由三羧酸循環(huán)的 中間產(chǎn)物 -酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化下，還原氨基化合 成谷氨酸。由于谷氨酸棒桿菌為生物素缺陷型突變株，要在培 養(yǎng)基中添加亞適量（濃度應(yīng)在 5g/L左右）生物素維持細(xì)胞正 常生長和控制細(xì)胞膜的透性達(dá)到高產(chǎn)谷氨酸的目的?；厥盏墓?氨酸又稱麩酸，并無鮮味，將其進(jìn)行中和精制得到味精。 等電點法提取谷氨酸原理 谷氨酸具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)，溶于水呈離子狀態(tài)，解離方式取決 于溶液 pH，在不同 pH溶液中，谷氨酸可解離成 GA+、 GA 、 GA-和 GA2+四種不同離子狀態(tài)。谷氨酸等電點是 3.22，故當(dāng)溶 液的 pH為 3.2時，溶液中大部分是 GA 兩性離子， 其分子內(nèi)部正 負(fù)電荷相等 ,并含有等量的帶不同電荷的陽離子 (GA+)和陰離子 (GA-),因此溶液中總靜電荷等于零。由于谷氨酸分子之間相互碰 撞 ,再通過靜電引力的作用 ,結(jié)合成較大的聚合體而被沉淀析出 , 因而處于 等電點時 GA的溶解度最小 。谷氨酸在不同條件下結(jié)晶， 會形成兩種不同晶形，一種為 型斜方晶體，顆粒大，容易結(jié)晶 析出，純度高；一種為 型鱗片狀結(jié)晶，比重輕，不宜沉淀分離， 往往夾有雜質(zhì)與膠體結(jié)合，浮于液面或母液中，純度低。等點操 作中應(yīng)盡量控制 型晶體的形成。 又由于溫度對 GA的溶解度影響 很大 ,溫度越低溶解度越小 ,生產(chǎn)上多采用 0 4 。 三 實驗用品 一）儀器：試管、三角燒瓶、紗布、吸管、接種 環(huán)、試管、燒杯、 752（ 7200）分光光度計、高 壓滅菌鍋、電子天平、超靜工作臺、 10L自動發(fā) 酵罐、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、搖床、旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀等 二）菌種 谷氨酸棒桿菌 （實驗室提供） 三）培養(yǎng)基 1.斜面培養(yǎng)基（ g/L） 酵母粉 0.5，蛋白胨 1，氯化鈉 0.5， pH 7.0 121 滅菌 30min 2種子培養(yǎng)基（ g/L）： 葡萄糖 25，玉米漿 30（ 2330）， MgSO4 0.5， K2HPO4 1.5， MnSO4 0.02， FeSO4 0.02， 尿素 5。 pH值 7.0 7.2 121 滅菌 30min 3發(fā)酵培養(yǎng)基（ g/L）： 葡萄糖 140、糖蜜 2.0（ 玉米漿 6） Na2HPO4 1.0， KCl 1.2， MgSO4 0.8， MnSO4 0.02， FeSO4 0.02， VB1 0.2mg， pH 7.0 7.2。 4補料溶液： 葡萄糖 600g/L，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 40%尿素（氨水 25%） 5消泡劑 0.01%（消泡劑配制后經(jīng)滅菌、冷卻后備用 ) 四 實驗內(nèi)容 （ 一） 工藝流程 原料的預(yù)處理及淀粉水解糖的制取 谷氨酸生產(chǎn)菌種子的擴(kuò)大培 養(yǎng) 谷氨酸發(fā)酵 谷氨酸的提取與分離 由谷氨酸制成味精 及味精成品加工 （二）實驗步驟 1 斜面菌種制備 ：接種針挑取 1環(huán)原始菌種，于斜面培養(yǎng)基劃線， 在恒溫培養(yǎng)箱 32 培養(yǎng) 18-24h。 2液體種子培養(yǎng) ：接一環(huán)生長良好的斜面種子至裝有 50ml種子培 養(yǎng)基的 500ml三角瓶（ 1000ml裝 200-250ml） ，放在沖程為 8cm的往復(fù)式搖瓶柜上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 96r min，溫度 32 ， 培養(yǎng) 8-9h。 一級種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： pH 6.5 光密度 OD0.75以上 殘?zhí)?0.5%以下 鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，革蘭氏陽性， 無雜菌，八字形 占 95%以上 由于發(fā)酵罐的容積較小，所以省略了二級種子的 培養(yǎng)。 3-1 發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵罐培養(yǎng) 1培養(yǎng)基配制 按發(fā)酵培養(yǎng)基配制，用自來水定容至發(fā)酵罐容 積的 60%， pH調(diào)至 7.0-7.2。 2）滅菌 空消及空氣過濾系統(tǒng)滅菌 滅菌前檢查發(fā)酵罐及相關(guān)管路氣密性， 121 滅菌 30min，滅菌過程打開各路排氣閥門，空 氣過濾系統(tǒng)滅菌后通壓縮空氣吹干備用。 (罐小， 可省略 ) 2）實消 發(fā)酵罐加入培養(yǎng)基后，通過夾套預(yù)熱至 80 ， 直接通蒸汽滅菌， 121 滅菌 20min，再關(guān)閉蒸 汽，改用自來水冷卻至 32 。滅菌完畢通無菌 空氣保持罐內(nèi)正壓，防止染菌。 3）發(fā)酵工藝條件 采用 火焰接種法接種 ，接種量 10% 罐壓 控制在 0.05MPa 轉(zhuǎn)速 200750r/min，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速及通氣量控制 溶氧在 20%以上 當(dāng) pH降到 7.07.1左右， 及 時流加尿素（氨水） 。 前期 pH7.58.0， 中期降到 7.17.4，后期 7.0，在發(fā) 酵結(jié)束前 6小時停止流加尿素（ 氨水） ，接近放罐時 pH約 6.56.8 溫度： 0-5h 34 ； 5-10h 35 ； 10-18h 36 ； 18h26h 37 ； 26h后 37 OD凈增控制 : 總 OD=0.75 0.8。 殘?zhí)菨舛韧ㄟ^流加葡萄糖液（ 殘?zhí)窃?5%2.0%時是流加糖最佳時機 ）控制在 10- 15g/L。發(fā)酵周期在 36h內(nèi)，放罐時殘?zhí)菓?yīng) 低于 5g/L。流加糖占總投糖的 60%70%時 產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率較為理想。開始流加時機應(yīng)以 殘?zhí)橇?、耗糖速度、菌體的活力和轉(zhuǎn)型情況 為依據(jù) 泡沫控制 ：在發(fā)酵產(chǎn)生一定泡沫時，流加一 定量的消泡劑，每次流加約 40g/m3 。 4）放罐 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至 80 維持 15min滅菌， 并清洗發(fā)酵罐及補料瓶。 從發(fā)酵 4小時開始，每間隔 2小時測定 OD， pH，糖含 量，鏡檢 3-2 發(fā)酵培養(yǎng) 搖瓶發(fā)酵 取種子培養(yǎng)液以 10%接種量 接種至裝有 25mL發(fā)酵培 養(yǎng)基 的 500mL三角瓶中， 8層紗布封口，置巡回式搖 床 (220r/min)上振蕩培養(yǎng) 36h。添加 2滴 1%苯酚紅指 示劑，間歇流 40加尿素控制 pH 在 7.0 左右。溫度： 前期 32 33 ，后期 34 37 。轉(zhuǎn)速：前期 100r min，后期 220r/min。 發(fā)酵過程 參數(shù)測定 幻燈片 9 還原糖的測定 谷氨酸的測定 菌體形態(tài)觀察 菌體濃度測定 發(fā)酵過程參數(shù)的控制 DO值 pH 溫度 攪拌速度 發(fā) 酵 發(fā) 酵 液 冷卻接種 三角瓶培養(yǎng) 固體斜面培養(yǎng) 上罐實消 培養(yǎng)基的配制 谷氨酸發(fā)酵的工藝流程簡圖 6 谷氨酸的提取與分離 等電點法提取工藝 操作簡單，收率 60。周期長，占地面積大 晶種 4h 發(fā)酵液 菌體分離 清液（濃縮） 育晶點 停酸攪拌兩小時 邊冷卻邊緩慢調(diào)酸 2M HCL 等電點 低速 攪拌 結(jié)晶 68h 4 靜置沉降 4h濕谷氨酸 離心分離 谷氨酸 母液 1)發(fā)酵液預(yù)處理 采用金屬過濾膜過濾設(shè)備去除菌體及固形物雜質(zhì)，必要時可在膜過 濾前添加絮凝劑沉淀蛋白質(zhì)雜質(zhì)，添加發(fā)酵液體積 1.5%的粉末活性 炭在 80 下對發(fā)酵液脫色 20min，在 510nm下透光值達(dá)到 75%以上。 2）發(fā)酵液濃縮 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 70 、 -0.1 MPa真空度下濃縮發(fā)酵液體 積至原體積的 50%。 3）等點結(jié)晶 采用 2M HCL調(diào)節(jié)谷氨酸濃縮液 pH至 3.2，并緩慢攪拌 育晶 8h 4）晶體分離及干燥 采用真空抽濾設(shè)備分離谷氨酸晶體， 60 烘干并稱重。 7 谷氨酸制味精 谷氨酸用適量的 NaCO3溶液中和后，再經(jīng)過過濾、濃縮、 離心分離等步驟、最終制成味精。 工藝條件：濕谷氨酸：水：純堿：活性炭 =1： 2：（ 0。 30.34）： 0.01 1）在不銹鋼內(nèi)桶內(nèi)加入清水及活性炭升溫到 65 ，開 始攪拌 60r/min。投入谷氨酸， 成為飽和溶液。 2）緩慢逐步加入 NaCO3 中和到 pH6.4（試紙）， 加熱到 65 ，繼續(xù)攪拌 4）谷氨酸鈉的濃縮結(jié)晶： a.將澄清的脫色液（ 18- 20B/35 ）加到旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀（加料 1/2） ,真空度 80kPa以上， T70 濃縮至 3434.5 B/80 ，升溫 至 80 放料。放料后冷卻，攪拌 23h后開冷卻水降 溫，降溫到（室溫 +15 ） b.分離 ：抽濾（工業(yè)濾 布作介質(zhì) /真空抽濾設(shè)備 ） c.烘干：鼓風(fēng)干燥箱（ T60 ）干燥。即可得到味精 原粉。 注 中和液 除鐵、除鋅 ：硫化鈉法、樹脂法除鐵鋅。 五 注意事項 1菌種制備的整個過程牢固 無菌 概念，嚴(yán)防雜菌污染。 2流加糖消毒滅菌溫度不宜過高，切要迅速降溫至 3045 ， 105 在攪拌以防止糖液的焦化產(chǎn)生焦 糖和色素 ,流加過程中殘?zhí)强刂屏坎灰撕龈吆龅汀?3等電點法提取谷氨酸注意 A、發(fā)酵液純度高：谷氨 酸 /殘?zhí)潜戎蹈?，膠體少，提前除菌體最好； B、發(fā) 酵液處理要及時； C、加酸調(diào) pH、溫度、育晶時間、 攪拌服從結(jié)晶規(guī)律，特別是觀察到晶體后，要停攪 拌 2h 育晶，否則產(chǎn)物無法沉淀。 D谷氨酸結(jié)晶操作 中要控制條件， 避免 型結(jié)晶析出。 4中和使用 NaCO3，在 pH7左右得到谷氨酸一鈉，在 pH9-10得到的是谷氨酸二鈉，因此中和應(yīng)嚴(yán)格控制 反應(yīng)的 pH。 5注意配料順序：硫酸鎂和磷酸氫二鉀應(yīng)分別溶解， 交叉加入 六實驗數(shù)據(jù)處理方法 1）菌體 OD ： 吸取 0.5ml發(fā)酵液，加入 9.5ml水稀釋并 搖勻，采用 7200分光光度計于 600nm下（ 752型 620nm） 測定吸光值。 2） pH值 :在線測定 3） 還原糖 含量 :用裴林試劑測定 4） 鏡檢 ：每隔 6小時檢測菌體的生長狀況，要求無雜菌 和噬菌體。 5） GA含量： 從發(fā)酵 12小時開始，每隔 4小時測定 GA 含量 ， GA用 茚三酮比色法 測定。 6）糖酸轉(zhuǎn)化率 發(fā)酵液中生成的谷氨酸量和消耗的葡萄糖質(zhì)量的比例。 轉(zhuǎn)化率 =Vt GA%/V0 初糖 %(Vt 發(fā)酵放罐體 積 ;V0 初始定容體積 ) 七實驗結(jié)果分析 1 實驗過程中每間隔 2h取樣一次，分別測定還原糖、 溶氧、通氣量、 PH、菌體濃度、谷氨酸含量等指標(biāo)的 過程曲線，繪制谷氨酸發(fā)酵過程曲線圖，并解釋曲線 變化的原因。 2、計算谷氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率、谷氨酸提取收率 等指標(biāo)； 以發(fā)酵零小時的投入糖量除以發(fā)酵終 了的谷氨酸總質(zhì)量，得到谷氨酸的轉(zhuǎn)化率。 3比較各小組實驗結(jié)果，評價本小組谷氨酸發(fā)酵及味 精制作的結(jié)果，總結(jié)實驗過程中的得與失。 4根據(jù)所得產(chǎn)量，分析影響味精產(chǎn)量的因素。 八 思考題 1為什么以尿素為氮源的發(fā)酵控制中，增加風(fēng)量 和提高溶氧會造成發(fā)酵液 PH的上升？ 2以谷氨酸發(fā)酵過程中 pH值的變化規(guī)律為例，說 明為什么 pH值的變化是反應(yīng)過程中菌體生長和產(chǎn) 物合成的綜合性指標(biāo)？ 3發(fā)酵過程實現(xiàn)高的產(chǎn)酸，應(yīng)如何防止雜菌及噬 菌體感染？ 主要參考文獻(xiàn) 發(fā)酵工程實驗指導(dǎo) 吳根福 主編 高等教育出版社 2006.5ISBN7-04-018619-5 生物工程專業(yè)實驗 賈世儒 主編 中國輕工業(yè)出版社 2004.7 ISBN7-5019-4390-7 固定化原生質(zhì)體半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸 文章編號 0254-5071（ 2010） 06-0121-02 繆靜 馮志彬 呈顯好 張玉香 程仕偉 張健勇 Intnert 謝謝 ！ 緩沖 溶 液 的 制 備 : 配 制 p H 6 . 0 的 NaAc - HAc 緩沖溶液。 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制 :用天平準(zhǔn)確稱取 1. 0000g谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 ,溶于 1L 緩沖溶 液中。 再采用逐級稀釋法配得濃度為 80 g/ mL、 90 g/ mL至 140 g/ mL 的谷氨酸 標(biāo)準(zhǔn)液。 茚三酮試劑的制備 :稱取 0. 5g 茚三酮溶于 100mL 水中得到 5g/ L 的茚三酮水 溶液。 1 實驗方法 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 分別吸取 80 140g/ mL 的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液 5mL 于 25mL 的比色管中 ,各加入 1mL 的茚三酮試劑 ,加上塞充分搖勻。將其置于 90 下水浴 20 25 min ,冷卻至室 溫 ,用 7200 型分光光度計在 569nm 下測得其光密度值 2 。以標(biāo)準(zhǔn)液的光密度值和 濃度做一標(biāo) 準(zhǔn)曲線。 3 樣品的測定 稀釋待測液于 80 140g/ mL 內(nèi) (谷氨酸發(fā)酵液濃度一般在 8 % 14 % ,測量 時稀釋 1000 倍即可 ) ,調(diào) p H 為 6. 0。以同樣的反應(yīng)量與反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng) ,并 在 569nm 下測定其光密度值。由以上所得標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)查得待測稀釋液的濃 度 ,再乘以稀釋倍數(shù)即為谷氨酸待測液的濃度。