十字花科植物DFR蛋白的生物信息學(xué)分析

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1、十字花科植物DFR蛋白的生物信息學(xué)分析 植物花色主要是由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大色素決定的?；ㄇ嗨厥且活愂种匾念慄S酮化合物，廣泛分布于各種植物中，其賦予了植物花、葉和果實各種顏色【1】，它主要調(diào)控花、葉和果實生成紅色、紫色和藍(lán)色。花色苷合成過程中，二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變成花色苷的反應(yīng)非常復(fù)雜，二氫黃酮醇4-復(fù)原酶〔dihydroflavonol4-reductase，DFR〕是這一轉(zhuǎn)變中起作用的第一個酶，失去DFR活性的突變體產(chǎn)生象牙色或者白色【2】。DFR是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是一個重要的調(diào)控點。它以二氫堪非醇〔dihydrokaempferol，DHK〕、二氫櫟皮黃酮〔di

2、hydroquercetin，DHQ〕和二氫楊梅黃酮〔dihydromyricetin，DHM〕為底物，在輔因子NADPH的作用下將4位的羰基復(fù)原為羥基，產(chǎn)生相應(yīng)的不穩(wěn)定無色花青苷元，然后這些無色花青苷元在花色素合酶〔anthocyanidinsynthase，ANS〕和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶〔flavonoid3-O-glucosyltransferase，3GT〕的催化下分別形成矢車菊素、天竺葵素和翠雀素[3-5]。DFR基因調(diào)控機制的研究對于了解花色素苷生化合成途徑和花朵顯色的分子機制有重要的意義【6】。目前，DFR基因在很多植物中均已被克隆，由于DFR基因具有底物特異性，利用該特點可

3、以定向改良花的顏色【7】。自1987年Meyer等[8]將玉米DFR基因?qū)氚珷颗C01突變體使花色由白色變?yōu)榈u紅色以來，其在改造花色方面的應(yīng)用取得了很多進(jìn)展[9-12]。該研究采用生物信息學(xué)的方法，對十字花科植物DFR氨基酸序列的組成成分、理化特性、亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行預(yù)測和推斷，以期為進(jìn)一步研究十字花科花色素苷生物合成的分子機制以及選育不同花色的植物資源提供根底資料。1材料與方法1.1數(shù)據(jù)獲取以dihydroflavonol4reductase為信息探針?biāo)阉鱊CBIGene數(shù)據(jù)庫〔s：//ncbi.nlm.nih.gov/gene/〕，獲得十字花科植物的基因序列及編碼的相應(yīng)蛋白

4、質(zhì)序列。1.2DFR蛋白質(zhì)序列分析及亞細(xì)胞定位利用ProtParm在線分析軟件〔：//web.expasy.org/protparam〕預(yù)測各蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及等電點信息[13]。使用WoLFPSORT在線分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位〔：//genscript -/wolf-psort.html〕。1.3DFR蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點分析通過NCBICDD〔s：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi〕〕平臺獲取蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域[14];利用MEMEVersion4.12.0軟件分析蛋白質(zhì)的保守Motif〔：//meme-suite.

5、org/tools/meme〕[15];利用NetPhos3.1進(jìn)行蛋白質(zhì)的磷酸化位點預(yù)測〔：//cbs.dtu.dk/services/NetPhos/〕[16-17]。1.4DFR蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析利用SOPMA工具〔s：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html〕預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。1.5DFR蛋白質(zhì)同源性比較及進(jìn)化分析用DNAMAN8軟件進(jìn)行序列多重比對分析;使用MEGA7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用pdistance模型，并設(shè)置Bootstrap值為1000進(jìn)行校正，生成最終的系統(tǒng)進(jìn)化

6、樹[18]。2結(jié)果與分析2.1DFR蛋白序列分析及亞細(xì)胞定位利用NCBIGene數(shù)據(jù)庫，筆者選取了24個其中擬南芥〔Arabidopsisthaliana〕2個、琴葉擬南芥〔Arabidopsislyrata〕3個、甘藍(lán)型油菜〔Brassicanapus〕5個、甘藍(lán)〔Brassicaoleracea〕3個、白菜型油菜〔Brassicarapa〕3個、亞麻芥〔Camelinasativa〕5個、蘿卜〔Raphanussativus〕3個。這些蛋白質(zhì)中序列最長的是RsDFR01〔387aa〕，最短的是AtDFR0401〔326aa〕;外顯子數(shù)目5～7個，大局部都有6個外顯子;分子質(zhì)量36481.8

7、9～43129.21Da;等電點最大的為AlDFR03〔pI=8.80〕，最小的是AlDFR01〔pI=5.07〕，大局部DFR蛋白等電點呈現(xiàn)酸性;利用WoLFPSORT分析亞細(xì)胞定位說明有2個基因所編碼的蛋白定位在細(xì)胞核，17個定位在葉綠體，5個定位于細(xì)胞質(zhì)〔表1〕，可見大多數(shù)基因編碼的蛋白都定位于葉綠體中。2.2蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點分析DFR蛋白屬于SDR〔shortchaindehydrogenase/reductase，SDR〕蛋白家族，該基因家族有2個高度保守功能結(jié)構(gòu)域，即NADP的結(jié)合功能域和底物特異結(jié)合功能域。利用NCBI的CDD在線分析24個十字花科植物的DFR基因所編

8、碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，除了BnaDFRA402只發(fā)現(xiàn)酶活性部位和底物特異結(jié)合區(qū)域，其他的基因編碼的蛋白均具有酶活性部位、NADP結(jié)合位點和底物特異結(jié)合位點〔表2〕。利用在線軟件MEME分析了DFR蛋白的保守motif，搜索了5個較保守的motifs〔圖1〕，大局部DFR蛋白都含有5個較保守的motifs，但BnaDFRA402只有4個motifs，缺失motif1;BoDFRC702、BrDFRA302、RsDFR03和AlDFR03只有3個，缺失motif1和motif4〔圖2〕。從保守motif序列和位置來看，這些保守的motif均處于保守結(jié)構(gòu)域中，即酶活性部位、NAD〔P〕結(jié)合位點和底物特

9、異結(jié)合位點區(qū)域，也進(jìn)一步說明這些位點對于DFR蛋白功能是保守的。蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測顯示，其均含有多個磷酸化位點，平均45個磷酸化位點，以BnaDFRC701最多，有53個，AtDFR0401最少，僅30個;3種磷酸化類型中，以絲氨酸〔Ser〕磷酸化位點最多，其中又以BnaDFRC701最多〔32個位點〕，CsDFR1801最少〔18個位點〕;其次是蘇氨酸〔Thr〕磷酸化位點，以AlDFR01和AlDFR02最多〔19個位點〕，AtDFR0401最少〔8個位點〕;以酪氨酸〔Tyr〕磷酸化位點最少〔圖3〕?？梢姡只艱FR蛋白的磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔。2.3DFR蛋白

10、的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用SOPMA軟件對DFR蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖4所示，24個DFR蛋白的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)那么卷曲組成，其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)元件，所占比例為33.85%～51.85%，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最低，以CsDFR2021最高為13.53%，CsDFR1201最低僅為7.43%。2.4DFR蛋白質(zhì)同源性比較分析利用DNAMAN對十字花科DFR蛋白進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果說明24個DFR蛋白的氨基酸序列，由于具有種屬差異，相似性為57.16%，但在重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域序列保守性高，如DFR與NADP結(jié)合區(qū)域和底物結(jié)合區(qū)域〔圖5〕。2.5DFR蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的

11、構(gòu)建根據(jù)不同植物DFR蛋白氨基酸多序列比對結(jié)果，結(jié)合鄰近連接法用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖6所示，24個DFR蛋白共分成兩大族，其中AlDFR03、RsDFR03、BoDFRC702和BrDFRA302聚為一族，其他20個蛋白聚為一族。由此看出，同一種屬的DFR蛋白并不完全聚在一起，有些甚至不在同一個族，因此該類蛋白不宜用于十字花科的親緣關(guān)系鑒定及遺傳進(jìn)化分析。3結(jié)論與討論花色是衡量欣賞植物的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，改變花色一直是轉(zhuǎn)基因花卉研究比較熱門的問題。隨著鄉(xiāng)村旅游的開展，油菜花旅游逐年升溫，但單一的黃色油菜花限制了其欣賞價值，因此創(chuàng)制新花色油菜有重要意義。二氫黃酮醇4-復(fù)原酶屬于NA

12、DPH依賴性短鏈復(fù)原酶家族，又屬于細(xì)胞色素P450家族，作為花色素苷合成的關(guān)鍵酶而受到廣泛關(guān)注。隨著測序技術(shù)的開展，公共數(shù)據(jù)量日益增加促使生物信息學(xué)成為后基因組時代用于預(yù)測和研究基因功能的重要方法。該研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對擬南芥、甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、蘿卜等十字花科植物的24個DFR蛋白序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果說明十字花科的DFR蛋白均具有NAD〔P〕結(jié)合位點和底物特異結(jié)合位點，且序列較為保守，亞細(xì)胞定位主要在葉綠體，磷酸化以Ser為主，以Thr和Tyr磷酸化為輔，但不同種屬的DFR蛋白序列具有一定差異，同一種屬的DFR蛋白并不聚在一起，說明這些DFR在功能

13、上也是有差異的，這些分析為該類基因表達(dá)和功能研究提供了參考，也為將來研究油菜花色形成分子機制及利用基因工程技術(shù)創(chuàng)新彩色油菜種質(zhì)資源提供了根底資料。參考文獻(xiàn)【1】陳大志，周嘉裕，李萍.二氫黃酮醇-4-復(fù)原酶的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通報，2021〔12〕：206-212.【2】楊宏霞，曲柏宏，劉振坤，等.延邊蘋果梨PyDFR基因的克隆及表達(dá)分析[J].北方園藝，2021〔4〕：99-103.【3】周琳，王雁，任磊，等.牡丹二氫黃酮醇-4-復(fù)原酶基因PsDFR1的克隆及表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報，2021，47〔9〕：885-892.【4】TANAKAY，SASAKIN，OHMIYAA.B

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