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1、植物總RNA提取
實(shí)驗(yàn)方法原理
通過裂解液β-巰基乙醇迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，植物RNA助提劑PLANTaid幫助結(jié)合多糖多酚并通過離心去除，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的RNase free H2O將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
實(shí)驗(yàn)材料
新鮮植物組織
試劑、試劑盒
β-巰基乙醇 乙醇 蛋白液RW1 漂洗液RW 蒸餾水 無菌水
儀器、耗材
研缽 離心管 離心機(jī) 移液槍 移液管 收集管 吸附柱 水浴鍋
2、實(shí)驗(yàn)步驟
一、 新鮮植物組織稱重后取100 mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100 mg放入研缽）， 加入10體積（1 ml）RLT(請(qǐng)確定已加入β-巰基乙醇)和1體積（100 ul） PLANTaid植物助提劑PLANTaid是針對(duì)植物RNA提取時(shí),富含多糖多酚等不容易清除的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的一種多糖多酚植物RNA提取的輔助劑,主要成份包括聚乙烯吡咯烷酮等高分子化合物.它們可以和多糖多酚等雜質(zhì)結(jié)合,通過離心去除.它和絕大多數(shù)常用的使用離序鹽（chaotropic salts ）如異硫氰酸胍的RNA提取方法兼容.使用方法簡便,只要在正常的RNA提取步驟中加一
3、步的步驟即可.將PLANTaid加入裂解液后,研磨,勻漿,PLANTaid和多糖多酚等雜質(zhì)結(jié)合,離心將PLANTaid,多糖多酚和任何不溶解的雜質(zhì)去除.取上清就可以繼續(xù)后面的正常RNA提取步驟了.
室溫下充分研磨成勻漿，注意應(yīng)該迅速研磨讓組織和裂解液RLT立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。
二、將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13 000 rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid，取450 ul 裂解物上清轉(zhuǎn)到一個(gè)新離心管。
三、加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
四、將混
4、合物(每次小于700 ul，多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm離心60秒，棄掉廢液。
五、加700 μl 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
如果DNA殘留明顯，可在加入RW1后室溫放置5分鐘后再離心。
六、加入500 ul漂洗液RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500 ul漂洗液RW，重復(fù)一遍。
七、將吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
八、取出吸附柱RA，放入一個(gè)
5、RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50 ul RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12 000 rpm 離心1分鐘。
九、如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30 ug，加30-50 ul RNase free water重復(fù)步驟7， 合并兩次洗脫液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高，分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15-30%，但是濃度要低，用戶根據(jù)需要選擇。
注意事項(xiàng)
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到1
6、3 000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2. 需要自備乙醇，β-巰基乙醇，一次性注射器（可選），研缽。
3. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. 植物組織裂解是否充分直接影響到RNA 提取的質(zhì)量和產(chǎn)量，本試劑盒中提供的裂解液RLT，主要成分為異硫氰酸胍，適用于大多數(shù)植物組織的裂解，但有些植物組織（例如玉米的乳白色胚乳）或絲狀真菌，由于次級(jí)代謝產(chǎn)物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產(chǎn)生固化，導(dǎo)致RNA 無法提取，此時(shí)可以向我們索取另一種
7、裂解液RLC，將解決該問題。
5. 關(guān)于DNA 的微量殘留
一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留,本公司的EASYspin系列RNA提取產(chǎn)品，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和選擇了特殊吸附能力的吸附膜，在大多數(shù)RT-PCR 擴(kuò)增過程中極其微量的DNA殘留（一般電泳EB染色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大，如果要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA表達(dá)量分析如熒光定量PCR，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：
1) 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。
2) 選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。
3)
8、將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup)，請(qǐng)聯(lián)系我們索取具體操作說明書。
4) 在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進(jìn)行DNase I處理。請(qǐng)聯(lián)系我們索取具體操作說明書。
6. RNA 純度及濃度檢測
完整性： RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5xTBE電泳緩沖液；150 v，15 分鐘)檢測完整性。由于細(xì)胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA 條帶。動(dòng)物rRNA 大小分別約為5 kb 和2 kb，分別相當(dāng)于28S 和
9、18S rRNA。動(dòng)物RNA 樣品中最大rRNA 亮度應(yīng)為次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴(yán)重降解。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris， pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260，OD280 測定，按照以下公式進(jìn)行RNA濃度的計(jì)算：終濃度（ng/μl）= (OD260)x(稀釋倍數(shù)n)x40
植物總RNA提取
