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1、植物總 DNA的提取 化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)教研室 1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 2 學(xué)習(xí)和掌握學(xué)習(xí) CTAB法提取植 物總 DNA的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 學(xué)習(xí)和掌握紫外光吸收法鑒定 DNA的純度和濃度。 2.實(shí)驗(yàn)原理 植物葉片經(jīng)液氮研磨，可使細(xì)胞壁破裂，加入去污劑（如 CTAB），可使核蛋白 體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀， DNA 進(jìn)入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實(shí) 驗(yàn)采用 CTAB法，其主要作用是破膜。 CTAB 是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂 肪，也可解聚核蛋白。植物材料在 CTAB的 處理下， 結(jié)合 65 水浴使細(xì)胞裂解、蛋 白質(zhì)變性、 DNA 被釋放出來(lái)。
2、CTAB與核酸 形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（ 0.7mM） 濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度 （ 0.1-0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸復(fù)合物就 因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì) 及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)過(guò)氯仿 / 異 戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色 素等來(lái)純化 DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等沉 淀劑將 DNA沉淀分離出來(lái)。 由于核酸、蛋白質(zhì)、多糖 在特定的紫外波長(zhǎng)都有特征吸 收。核酸及其衍生物的紫外吸 收高峰在 260nm。純的 DNA樣品 A260/2801.8 ，純的 RNA樣品 A260/2802.0 ，并且 1g/ml DNA溶液 A260=0.020
3、。 3.實(shí)驗(yàn)器材與試劑 1、高壓滅菌鍋 2、冰箱 3、恒溫水浴鍋 4、高速冷凍離心機(jī) 5、紫外分光光度計(jì) 6、剪刀 7、陶瓷研缽和杵子 8、磨口錐形瓶（ 50ml） 9、滴管 10、細(xì)玻棒 11、小燒杯（ 50ml） 12、離心管（ 50ml） 13、植物材料 3.實(shí)驗(yàn)器材與試劑 1、 3 CTAB buffer（ pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% -巰基乙醇 2、 TE緩沖液（ pH8.0） 10mmol/L TrisHCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿 -異戊醇混合液（ 24： 1， V/V） 4、 95乙醇 5、液氮
4、4.實(shí)驗(yàn)步驟 1、稱(chēng)取 0.1g新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。 2、將葉片剪成 l cm長(zhǎng)，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研磨成 粉末。 3、將液氮揮發(fā)完后，加入 0.5 ml預(yù)熱（ 60 ）的 CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入 一離心管中，置于 65 水浴保溫 0.5 h，不時(shí)地輕輕搖動(dòng)混勻。 4、取出稍冷后，加等體積的氯仿：異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，室溫下 7000 rpm離心 10 min。 5、用一開(kāi)口較大的滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中，加 2倍體積 的乙醇（ 95%乙醇），輕輕混勻，使核酸沉淀下來(lái)，室溫下 10000 rpm 離心 10 min。 6、倒掉
5、上清夜，向離心管中加 1 ml洗滌緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使核酸 沉淀懸浮起來(lái)，洗滌 2 min，在室溫下 5000 rpm離心 5 min。 7、重復(fù)洗滌一次，并于室溫下使 DNA沉淀干燥，變?yōu)橥该鳡睢?8、將 DNA沉淀溶于 100l TE溶液中，于 -20 保存?zhèn)溆谩?9、用于后續(xù)濃度及純度的檢測(cè)，將 DNA沉淀溶于 1 ml TE溶液中，在分光 光度計(jì)上測(cè)定該溶液在 260nm/280nm紫外光波長(zhǎng)下的吸光度值。 5.注意事項(xiàng) 1. 液氮研磨時(shí)，小心操作，以免凍傷。 2. 所有操作均需溫和，避免劇烈震蕩。 6.思考題 1. CTAB、 EDTA、巰 基乙醇的作用分別 是什么？ 2. 液氮研磨的原理是 什么？
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