固定化酶及固定化技術(shù)

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1、第五章 固定化酶及固定化技術(shù) 酶： 在水溶液中不穩(wěn)定 一次性使用 -難回收，難連續(xù)化生產(chǎn) 用于醫(yī)藥 /化學(xué)分析純度要求高 產(chǎn)物的分離純化困難 。 要求將酶變成不溶性 實(shí)際上將酶限制在一定空間 固定化 固定酶具有催化活性 1916年，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn) ， 酶和載體結(jié)合以后 ，在 水中呈不溶解狀態(tài)時(shí)， 仍 然具有生物催化活性 。 固定化酶可重復(fù)使用 操作穩(wěn)定性 酶在固定化后其活力可以緩慢釋放 , 酶的穩(wěn)定 性比天然狀態(tài)高 , 可重復(fù)多次使用 . 結(jié)果如圖所示 : 固定化酶的活力基本保持穩(wěn)定活力損失 15% ,由此可見該固定化酶具有良好的 操作穩(wěn)定性 例 :將 0.5g DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶

2、 與 10mL 1%殼聚糖 溶 液在 60 下連續(xù)反應(yīng) 10 次每次反應(yīng)時(shí)間為 6h 每次反應(yīng)后 分別測定酶活力 一、固定化酶（ immobilized enzyme） 水溶性酶 水不溶性載體 固定化技術(shù) 水不溶性酶 （固定化酶） 什么是固定化酶？ 固定化酶：是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，限制 在一定的空間范圍內(nèi)，可以反復(fù)使用而又能發(fā) 揮催化作用的酶制劑。 酶的固定化技術(shù)包括 吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合（ 化學(xué)偶聯(lián)）及包埋 等多種方法。 與固定化酶技術(shù)相配套的 是酶生物反應(yīng)器 同一般的化工容器一樣，需要對(duì)酶反應(yīng) 器溫度和 pH等條件進(jìn)行嚴(yán)格的控制；不 同的是，酶反應(yīng)器必須進(jìn)行無菌操作。 酶生物反應(yīng)器 簡

3、 史 1916年， Nelson 載體的影響 ： 在固定化酶的周圍，形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的 擴(kuò)散層以及靜電的相互作用等引起的變化。 載體與酶的相互作用： 載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié) 構(gòu)、封閉酶活性部位等。 改變之一：構(gòu)象改變、立體屏蔽 構(gòu)象改變： 酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，導(dǎo)致 酶與底物結(jié)合能力或催化能力下降 立體屏蔽： 固定化后，使得酶的活性中心或 調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使得效 應(yīng)物或者底物與酶的臨近或者接觸受 到干擾 改變之二：分配效應(yīng)、擴(kuò)散限制 微環(huán)境： 微環(huán)境 是指在固定化酶附近 的局部環(huán)境，而把主體溶液 稱為 宏觀環(huán)境 。 分配效應(yīng)： 由于載體性質(zhì)，造成底

4、物和 效應(yīng)物等在微觀體系和宏觀 體系之間的不等性分配，從 而影響酶促反應(yīng)速度 擴(kuò)散限制效應(yīng)：底物、產(chǎn)物和效應(yīng)物等，在環(huán) 境中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度收到限制 DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶 :以 DEAE 纖維素為載體戊二醛為交聯(lián)劑 固定殼聚糖酶 改變之三：微擾 由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性 質(zhì) , 直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng) 的能力 1.固定化后酶活力的變化 固定化酶的活力在 多數(shù)情況 下比天然酶小，其專一性也能發(fā) 生改變。 例如： 用羧甲基纖維素載體固定的胰蛋白酶消化不同底物： 酪蛋白（ 高分子）原酶活力的 30% 苯酞精氨酸 -對(duì)硝基酰替苯胺 (低分子 )原酶活力的

5、80%。 一般認(rèn)為高分子底物受到 空間位阻的影響 比低 分子底物大。 原因： 酶結(jié)構(gòu)的變化 空間位阻 不過，也有個(gè)別情況，酶在固定化后反 而比原酶活力提高，原因可能是偶聯(lián)過 程中酶得到化學(xué)修飾，或固定化過程提 高了酶的穩(wěn)定性。 Merlose曾選擇 50種固定化酶，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)： 30種酶穩(wěn)定性提高， 12種酶無變化， 8種酶穩(wěn)定性降低。 然而，由于目前尚未找到固定化方法與穩(wěn)定性之間規(guī)律性， 因此要預(yù)測怎樣才能提高穩(wěn)定性還有一定困難，但 大多數(shù)情 況下酶經(jīng)過固定化后穩(wěn)定性提高了 。 2.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因 可能有以下幾點(diǎn)： 固定化后酶

6、分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶 分子伸展變形。 酶活力的緩慢釋放。 抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后， 由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑 制了降解 固定化青霉素?；?將酶于 0.05 mol L的 PBS（ pH 7.5）中分別在 不同溫度下保溫 6小時(shí)， 冷卻后測定酶活力。 固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu) 于自然酶 。 固定化酶的穩(wěn)定性變化 1.固定化酶； 2. 自然酶 a.熱穩(wěn)定性提高 測試結(jié)果 :5天后其活性仍可保留 96% . 例 :將 DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶 浸泡在 95%的 乙醇 中， 連續(xù) 5天測其催化活性 b.對(duì)有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高 提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶

7、劑的穩(wěn)定性，使本來 不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。 提高酶對(duì)某些抑制劑的穩(wěn)定性 可以預(yù)計(jì)，今后固定化酶在有機(jī)合成中應(yīng)用會(huì)進(jìn) 一步發(fā)展。 c.對(duì) pH的穩(wěn)定性提高 青霉素?；冈诓煌?pH 值的緩沖液中，于 37 保溫 16 h測定酶活力。 固定化酶在 pH 5.5- 10.3活力穩(wěn)定； 游離酶則僅在 pH 7.0-9.0穩(wěn)定。 固定化酶的 pH穩(wěn)定性明 顯優(yōu)于游離酶。 d.對(duì)蛋白質(zhì)水解酶的抗性 固定化后載體與酶的緊密連接對(duì)其起一定保護(hù)作用 , 并在空間上阻礙酶與大分子物質(zhì)接近 , 從而降低了酶與 大分子物質(zhì)結(jié)合的幾率 ,防止酶被其他蛋白酶水解 . 此外： 有些固定化酶經(jīng)過貯藏，可以提高

8、其活性。 大多數(shù)酶經(jīng)固定化后提高了貯藏的穩(wěn)定性，如 固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在 4 下， 120天酶活力 無變化。 對(duì)操作穩(wěn)定性都有影響 如圖：固定化酶的最適 溫度為 60 C ，而游離酶 的最適溫度為 50 C 而固 定化酶在 50- 65 C 范圍 內(nèi)都保持了較高的酶活力 ,這說明殼聚酶經(jīng)固定化 后其在較高溫度下的適應(yīng) 范圍有了明顯提高 3.固定化酶的最適溫度的變化 固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高， 所以固定化酶的最適溫度提高 當(dāng)然，也有報(bào)道最適溫度不變或下降的。 4.最適 pH值的變化 酶的催化能力對(duì)外部環(huán)境特別是 pH非常敏感。 酶固定化后，對(duì)底物作用的最適 pH和 pH-活性曲 線常常發(fā)

9、生偏移。 pH對(duì)固定化酶的影響 1） 載體帶負(fù)電荷， pH向堿性方向移動(dòng)。 載體帶正電荷， pH向酸性方向移動(dòng)。 （ 2）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系 pH的影響 催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適 pH比游離酶的最適 pH值；反之則低 例 :取 0.2g DEAE 纖維素固定化殼聚糖酶與 5mL殼 聚糖酶液各 8份分別于不同 pH下測定固定化酶和游 離酶的活力 可見：固定化酶的最適 pH 向酸性偏移 例：取 0.15g固定化黃曲 霉毒素解毒酶 和 4ML黃曲 霉毒素解毒酶 液各 8份， 分別于不同 pH下測定固定 化酶和游離酶的活力 可見：固定化酶的最適 pH 向堿性偏移 影響固定化酶 Km的因素：

10、1.酶的空間立體障礙 載體為電中性時(shí)，由于 擴(kuò)散限制 造成表觀 Km上升。 2. 電荷效應(yīng) （ 1） 載體與底物帶相同電荷， KmKm （ 2） 載體與底物電荷相反，靜電作用， KmKm 3.溶液的離子強(qiáng)度 5.固定化酶的米氏常數(shù)（ Km）變化 例：取 DEAE 纖維素固定化 殼聚糖酶 0.2g 與 1%殼聚糖 酶液 5mL 各 6 份分別加入 2mL 不同濃度的 殼聚糖溶 液 (0.4% 1.5%)于 50 C 水 浴中保溫 60min 測定還原 糖濃度，用雙倒數(shù)作圖求 得米氏常數(shù) 如圖 ：經(jīng)線性擬合可求得 Km(固 )=18.87g/L Km(游 ) =2.49g/L 五、評(píng)價(jià)固定化酶的指

11、標(biāo) 一般評(píng)價(jià)： 1 酶活定義（ IU)：在特定條件下，每一分鐘 催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為 1 個(gè)酶活單位。 2. 酶比活定義（游離）：每毫克所具有的酶 活力單位 固定化酶 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有 的酶活力單位。 或：單位面積（ cm2）的酶活力單位表示（酶膜、 酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活 力一半所需要的時(shí)間（ t1/2） 3.偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量 (或酶活力 )的百分?jǐn)?shù)表示： 由于在偶聯(lián)反應(yīng)中酶往往會(huì)有些失活，因此，測 定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力， 所以，仍以測定蛋白量較

12、為難確。 4. 活力回收 酶固定化 般比溶液酶的活力下降，固定化酶活 力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)稱為活力回收率 。 5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與 游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力 六、固定化細(xì)胞 利用胞內(nèi)酶制作固定化酶時(shí)，需要破碎細(xì)胞，然 后提取酶，這就增加了工序和成本。 科學(xué)家設(shè)想直接固定含所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞 固定化細(xì)胞與固定化酶比較，其 優(yōu)越性 在于： 保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境 ，因而更穩(wěn)定。 保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，而且無需輔酶再生 。 20世紀(jì) 70年代，科學(xué)家研制成固定化細(xì)胞，并且用于 生產(chǎn)。 例如，將酵母菌細(xì)胞吸附到多孔塑料的表面上或 包埋在瓊脂中，制成的固

13、定化酵母菌細(xì)胞，可以 用于酒類的發(fā)酵生產(chǎn) 固定化增殖細(xì)胞 發(fā)酵 更具有顯著優(yōu)越性 固定化細(xì)胞分類、形態(tài)特征和生理狀態(tài) ： 分類方式 固定化細(xì)胞類型 細(xì)胞類型 微生物、植 物、動(dòng) 物 生理狀態(tài) 死細(xì)胞：完整細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞器 活細(xì)胞：增殖細(xì)胞，靜止細(xì)胞，饑餓細(xì)胞 形態(tài)特征： 固定化細(xì)胞由于其用途和制備方法的不同，可以是顆粒 狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則狀（與吸附物形狀相 同）等， 目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體，這是因?yàn)椋?不規(guī)則形狀的固定化細(xì)胞易磨損，在反應(yīng)器內(nèi)尤其是 柱反應(yīng)器內(nèi)易受壓變形，流速不好， 圓形珠體由于其表面積最大，與底物接觸面較大，所 以生產(chǎn)效率相對(duì)較高。 細(xì)胞被固定在載體內(nèi)在

14、形態(tài)學(xué)上一般沒有明顯的變化 。但是，掃描電鏡觀察到固定化酵母細(xì)胞膜有內(nèi)陷現(xiàn) 象。無論用海藻酸鈣、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠包 埋，都有類似情況。形成 “ 凹池 ” 的原因尚待進(jìn)一步 研究。 固定化死細(xì)胞： 一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng) 過物理或化學(xué)方法的處理，如加熱、勻漿、干燥 、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加 細(xì)胞膜的滲透性或抑制副反應(yīng)，所以比較適于單 酶催化的反應(yīng)。 固定化靜止細(xì)胞 和 饑餓細(xì)胞 在固定化之后細(xì)胞是 活的，但是由于采用了控制措施，細(xì)胞并不生長 繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。 固定化增殖細(xì)胞 又稱固定化生長細(xì)胞，是將活細(xì) 胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應(yīng)過程中保持旺

15、 盛的生長、繁殖能力的一種固定化方法。 與固定化酶和固定化死細(xì)胞比較 固定化增殖細(xì)胞能夠不斷繁殖、更新，反應(yīng)所需的酶也就可以 不斷更新，而且反應(yīng)酶處于天然的環(huán)境中，更加穩(wěn)定，因此， 固定化增殖細(xì)胞更適宜于連續(xù)使用。從理論上講，只要載體不 解體，不污染，就可以長期使用。固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞原有 的全部酶活性，因此，更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)，所以 說，固定化增殖細(xì)胞在發(fā)酵工業(yè)中最有發(fā)展前途。 固定化增殖細(xì)胞發(fā)酵的優(yōu)越性 1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生 產(chǎn)菌集合體 2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用 3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。 (膜的 選擇通透

16、性） 4、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng) 5、抗污染能力強(qiáng) 固定化細(xì)胞技術(shù)的局限性： (1)必須保持菌體完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。 (2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其 他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。 (3)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用 ,載體形成的孔隙 大小影響高分子底物的通透性 . (4)如利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要 的副產(chǎn)物； 但這些缺點(diǎn)并不影響它的實(shí)用價(jià)值。 固定化酶與細(xì)胞的選擇依據(jù)： 對(duì)一個(gè)特定的目的和過程來說，是采用細(xì)胞，還是采用 分離后的酶作催化劑。要 根據(jù)過程本身來決定。 一般說 :對(duì)于一步或兩步

17、的轉(zhuǎn)化過程用固定化酶較合適 。對(duì)多步轉(zhuǎn)換，采用整細(xì)胞顯然有利。 缺點(diǎn)： 固定化后的細(xì)胞不易與反應(yīng)物接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降 固定化微生物和動(dòng)植物細(xì)胞的應(yīng)用 固定化微生物細(xì)胞：用于生產(chǎn)酒類、氨基酸、有 機(jī)酸、抗生素以及酶和輔酶，也可以用于有機(jī)溶 劑生產(chǎn)，廢水處理等 固定化植物細(xì)胞：主要用于生產(chǎn)人工種子、香精 、色素、藥物、酶等 固定化動(dòng)物細(xì)胞主要用于生產(chǎn)疫苗 七、固定化酶的應(yīng)用 1、在工業(yè)上的應(yīng)用 用固定化酶可以生產(chǎn) L-氨基酸，葡萄糖及葡糖漿、核苷酸、 半合成的抗生素母核等 L氨基酸的生產(chǎn)：用固定化酶（氨基?；福┱鄯?DL氨 基酸可連續(xù)生產(chǎn) L氨基酸。如固定化的細(xì)胞（大腸桿菌） 生產(chǎn) L

18、Asp：以 120L柱式反應(yīng)器 60天可生產(chǎn) 5噸的 L Asp。 乙酰 -DL -Ala L -Ala +乙酸 乙酰 -D Ala （ A-D-Ala） Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶 泵 儲(chǔ) 罐 反應(yīng)產(chǎn)物 離心機(jī) 消 旋 反 應(yīng) 器 固定化酶 柱子 晶體 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 固定化酶用于 水解牛奶中的 乳糖 牛奶中含有 4 3 -4 5的乳糖，乳 糖酶缺乏癥的人飲用牛奶后將導(dǎo)致不 良后果。用乳糖酶可以將乳糖分解為 組成乳糖的兩個(gè)單糖：半乳糖和葡萄 糖。用固定化乳糖酶反應(yīng)器可以連續(xù) 處理牛奶，將乳糖分解 乳糖在溫度較低時(shí)易結(jié)晶

19、，用固定化 乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋 類產(chǎn)品中結(jié)晶改善口感。 嚴(yán)重腎臟疾病，需血液透析。過濾尿素和尿酸等代謝廢物 利用固定化脲酶透析液和活性碳構(gòu)成的體外循環(huán)裝臵 固定化脲酶：脲酶與離子交換樹脂通過微囊法制備而成的 脲酶水解尿素為氨和 CO2，氨被樹脂吸附， CO2由肺呼出， 其他代謝物由活性碳吸附 2.在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用 人工腎： 治療癌癥 正常細(xì)胞： L-Asn合成酶， Asn被消耗的同時(shí)不斷 合成維持細(xì)胞蛋白質(zhì)合成需要 癌細(xì)胞：缺少活無 L-Asn合成酶， Asn被消耗， 影響蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞 “ 餓死 ” 用固定化的 天冬酰胺酶 治療 白血病 利用尼龍或尿素聚合物半透膜制備成微囊

20、型 L-天冬酰胺酶 , 用于白血病治療。 改變了酶的最適 pH； 微囊型酶對(duì)蛋白酶穩(wěn)定； 注射到大白鼠腹腔內(nèi)，急性毒性很低、也不會(huì)產(chǎn)生抗體； 除制成微囊型外，還有人采用酶管或酶板形式進(jìn)行體外循 環(huán)治療，也達(dá)到了預(yù)期的療效。 微囊型固定化酶 將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合物內(nèi)，制成所謂的 微囊型固定化酶 。小分子底物或產(chǎn)物可自由地透過 膠囊的半透膜，而酶作為大分子則不能透過膠囊； 此外，膠囊外的一些蛋白質(zhì)、酶、抗體等高分子物 質(zhì)也不能進(jìn)入膠囊內(nèi)部，這就避免了發(fā)生過敏性反 應(yīng)。 膠囊型固定化 酶的另一大 優(yōu)點(diǎn) 是， 膠囊內(nèi)的酶仍以 溶解狀態(tài)作用于底物 。因此突破了狹義的固定化酶的 定義，也為固定化酶應(yīng)

21、用于臨床提供了可能性。 與此同時(shí)，人們采用人血清白蛋白替代尼龍、硝酸 纖維等作為制造膠囊的材料，使包裝材料更具有安全、 穩(wěn)定和體內(nèi)易代謝等特點(diǎn)。 是一種與 x染色體連鎖 的遺傳代謝病 患者由于先天性缺 乏 HGPRT，導(dǎo)致體內(nèi)次 黃嘌呤和鳥嘌呤補(bǔ)救途 徑的障礙，并進(jìn)而引起 腎結(jié)石、痛風(fēng)。 Lesch-Nyhan綜合癥 Chang等人利用 微囊型 嘌呤氧化酶治療 Lesch-Nyhan綜合癥，使次黃嘌呤的水平顯 著下降，同時(shí)發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤能很快地進(jìn) 入 微 囊體 中并被代謝。 在以兩歲半大的病孩所 做的臨床試驗(yàn)中，他們也發(fā)現(xiàn)效果很好。 藥物控釋載體： 新的藥物（包括化學(xué)合成藥、天然藥物及基因工程藥

22、物）不 斷問世，但將它們應(yīng)用于臨床卻并不很順利： 很多藥物尤其是蛋白質(zhì)類藥物，口服易被胃酸破壞或沉淀； 單純注射后瞬時(shí)血藥濃度升高，但馬上被肝臟及血液中的酶 系統(tǒng)所清除，需要反復(fù)注射，不僅增加治療費(fèi)用，而且增加 了感染的機(jī)會(huì)； 腫瘤化療用細(xì)胞毒性物質(zhì)選擇性較差，全身毒副作用嚴(yán)重； 有些藥物如反義核酸親水性強(qiáng)難于穿過細(xì)胞膜； 蛋白質(zhì)類藥物容易引起免疫反應(yīng)； 很多藥物穩(wěn)定性差，不耐貯存。 以上問題往往不能用簡單的藥物改構(gòu)來完成，因此， 為藥劑學(xué)工作者提出了嚴(yán)峻的任務(wù)。近 30年來，藥物 的新劑型發(fā)展很快，已逐步建立了基于藥物理化性質(zhì) 及作用特點(diǎn)的合理給藥體系， 其核心特點(diǎn)是從時(shí)間和 空間分布上控制

23、藥物的釋放。 在腫瘤的化學(xué)治療及重組蛋白質(zhì)類藥物制劑中比較 重要的幾種控釋體系有 聚合物修飾、凝膠包埋、微 球、脂質(zhì)體及免疫導(dǎo)向等 。 這幾種控釋體系都涉及到將藥物與聚合物載體偶聯(lián) 或固定于某種聚合物載體上，因此也可稱為 載體藥 物 聚合物修飾 多用于 蛋白質(zhì)類藥物 。這類藥物生物半衰期短、免疫 原性強(qiáng)，可用適當(dāng)?shù)乃苄愿叻肿泳酆衔锛右孕揎椧?改善其性能。 羧甲基殼聚糖對(duì)天門冬酰胺酶的修飾 ,聚 乙二醇對(duì)原核表達(dá)重組人血小板生成素 分子的修飾等，均可起到降低毒性、延 長半衰期的作用。 此外，小分子藥物也可使用這一系統(tǒng)， 如將抗癌藥，羥基硫胺素及氨甲蝶呤偶 聯(lián)于羧甲基纖維素后注射，可使荷瘤小 鼠

24、平均生存時(shí)間較對(duì)照組延長 2倍左右。 凝膠包埋 即用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制 成含有藥物的凝膠，植入體內(nèi)特定部位，以達(dá)到 緩釋給藥的效果。 藥物從凝膠中釋出后，經(jīng)周圍組織吸收，然后進(jìn) 入血液循環(huán)或直接局部作用， 避開了首過效應(yīng) ， 生物利用度高，作用時(shí)間長。 微球制劑 用高聚物微球包埋或化學(xué)偶聯(lián)藥物可制成微球 制劑，它具有：靶向性、緩釋性及減少抗藥性 等特點(diǎn)。微球與靶細(xì)胞接觸，可以通過胞飲進(jìn) 入胞內(nèi)發(fā)生作用，不影響細(xì)胞膜通透性，不會(huì) 產(chǎn)生抗藥性。 早期使用的微球制劑為不被生物降解的，多為口 服制劑?，F(xiàn)在用于注射的多為可生物降解小于 1 m的微球， 如以生物可降解微球包埋入生長激素

25、肌注動(dòng)物， 血藥濃度穩(wěn)定、不產(chǎn)生抗體，注射部位組織無病 變。微球還可用于基因治療及基因疫苗的載體。 脂質(zhì)體 -磷脂雙分子層在水溶液中，自發(fā)形成的超微型中空小泡。 現(xiàn)查明是因缺乏氨基己糖酶 A，使神經(jīng)節(jié)苷脂累積在組 織內(nèi)，從而出現(xiàn)神經(jīng)遲鈍、肌肉無力、失聰、視網(wǎng)膜有櫻 桃紅點(diǎn)等癥狀 . 黑蒙性癡呆 (Tay-Sach病 ) Weisman等用被覆抗體的脂質(zhì)體（內(nèi)含 氨基己糖酶 A）引入到 4例黑蒙性癡呆患者 細(xì)胞中，此時(shí)細(xì)胞不會(huì)把含酶的 脂質(zhì)體 當(dāng) 作異物。故能通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在 細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮酶的作用 。 此外，還有人利用嵌入從胎盤中提 純的葡萄糖腦苷酯酶的脂質(zhì)體來治療 Gaucher病，發(fā)現(xiàn)

26、也能獲得較好的療效。 缺點(diǎn) : 單純脂質(zhì)體也還是依靠被動(dòng)靶向性，因而 限制了其在腫瘤化療中的應(yīng)用； 脂質(zhì)體在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)、分布不穩(wěn)定，缺乏 對(duì)血管的通透性。 等等 導(dǎo)向藥物 導(dǎo)向藥物具有主動(dòng)靶向性，將針對(duì)腫瘤細(xì)胞的單 克隆抗體與化療藥物化學(xué)交聯(lián)，可以直接作用于 腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，并且降低全身毒性。 半透膜 酶膠層 感應(yīng)電極 酶電極示意圖 3.在分析化學(xué)中的應(yīng)用 在分析化學(xué)與臨床診斷中 ， 固定化酶被制成酶試紙 、 酶柱 與酶管 、 酶電極而得到廣泛的應(yīng)用 。 4.在基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用 主要集中在酶本身的生化和分子生物學(xué)研究以及蛋白質(zhì) 、 核 酸和遺傳工程中的研究應(yīng)用 。 此外，固定化酶及其

27、技術(shù)，還可以用于研究微生物的代謝機(jī) 理，研究生物發(fā)光機(jī)理等。 1）生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究 如：酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究、多亞基酶及多酶體 系組裝方式的研究及凝血及血栓溶解的生化過程 研究等。利用固定化酶在相界面催化反應(yīng)的特點(diǎn) ，還可用它來復(fù)制酶膜的模型。將多酶系統(tǒng)包埋 于微囊內(nèi)，可用于酶系統(tǒng)的組裝、定位及代謝的 研究等 闡明酶反應(yīng)機(jī)理 對(duì)于葡萄糖生成 3-磷酸甘油醛反應(yīng)，中間要經(jīng)過 已糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶、 醛縮酶的作用。將這些酶固定化后裝柱，讓葡萄 糖依次過柱，果然可得 3-磷酸甘油醛，這既說明 了每一個(gè)酶的作用，也可證明了該反應(yīng)的反應(yīng)機(jī) 制。 酶亞基性質(zhì)的研究 因?yàn)閬喕?/p>

28、不易分離，正常條件下無法比較 由于載體的空間限制，脫落的亞基不能再與載體上的亞基 重新結(jié)合，利于單亞基的研究 8 M 尿 素 透 析 醛縮酶有 4個(gè)亞基，控制條件使酶分子只有一個(gè)亞基通過共 價(jià)鍵與 CNBr活化的瓊脂糖凝膠結(jié)合。當(dāng)用 8 mol/L的尿素使 蛋白變性后，未被固定的亞基被透析除去，只有固定化的亞 基保留，這樣就可對(duì)單亞基進(jìn)行研究， 醛縮酶的亞基可有活性。 固定化衍生物 活力 蛋白質(zhì) 比活 全酶 100 100 4.5 亞基 9.8 27.5 1.6 揭示酶原激活機(jī)理 有時(shí)酶原激活并不涉及蛋白水解。酪氨酸酶原固定 化后，不須肽鏈水解就可活化至天然酶的 2030%活 力。熒光技術(shù)證明，活化酶原在結(jié)構(gòu)上與固定化酪 氨酸酶類似，證明了 結(jié)構(gòu)重排在酶原激活中的重要 性 。 此外： 蛋白質(zhì)在載體上的固定化可用于粗略闡明蛋白質(zhì) 的結(jié)構(gòu)。例如，蔗糖酶固定在帶電載體上，蛋白 質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中的許多鹽橋被破壞，而酶在很大程 度上失去穩(wěn)定性。這個(gè)事實(shí)說明，靜電相互作用 （特別是鹽橋）是蔗糖酶結(jié)構(gòu)完整性所必須的 固定化酶在實(shí)際中的其他應(yīng)用 醫(yī)藥 農(nóng)業(yè) 環(huán)保 食品 其他