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1、垂直電泳分離同工酶 （活性染色鑒定法） 實(shí)驗?zāi)康?： 理解同工酶的概念及遺傳學(xué)意義 學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳操作技術(shù) 掌握乳酸脫氫酶同工酶及酶活性染色 1. 同工酶 是指能夠催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但酶 分子結(jié)構(gòu)、理化特性乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一 組酶。 它們是由遺傳體系決定的在不同組織中 表達(dá)的蛋白質(zhì)作用相同 ,但分子結(jié)構(gòu)、理化特性 等不同 . 2. 由于同工酶存在蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的不同， 在電泳時條帶略有差異 ,因此可用電泳將它們分 離開來。 3. 本實(shí)驗做的是乳酸脫氫酶的分離鑒定 乳酸脫氫酶 用電泳方法將 LDH同工酶分離，分析其酶譜，發(fā)現(xiàn)脊椎動物各組 織中有五條酶
2、帶。每條酶帶的酶蛋白都是由四條肽鏈組成的四聚 體， LDH有兩類肽鏈， A（ M）或 B（ H），各有不同 同工酶的 免疫性質(zhì)，按排列組合可形成符合于電泳酶帶數(shù)的五種同工酶。 LDH1及 LDH5分別由純粹的 4條 B鏈（ B4）和 4條 A鏈（ A4）形 成，稱為純聚體；而 LDH2、 LDH3和 LDH4都是由兩類肽鏈雜交 而成的，分別可寫成 AB3、 A2B2、 A3B，稱為雜交體 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理 凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳是對 天然狀態(tài)生物大分子進(jìn)行的電泳，利 用蛋白質(zhì)分子中所帶凈電荷、分子質(zhì) 量、形狀的差異，而在電場中泳動的 速度和方向不同，達(dá)到分離的目的。 實(shí)驗器
3、材 ： 夾心式垂直板電泳槽，梳子，直流穩(wěn) 壓電源（電壓 300-600V， 電流 50- 100mA），移液槍（各種量程），燒杯 （ 100mL），培養(yǎng)皿 , 實(shí)驗流程 試劑的配制 儀器的準(zhǔn)備 動物組織的樣品的獲取 分離膠（ 30分鐘） 濃縮膠（ 30分鐘） 電泳（ 2-3小時） 染色（ 30分鐘） 觀察結(jié)果 一 、 試劑： 1.凝膠儲備液： 儲備液： pH8.9 TrisHCl緩沖液： 1 M HCl 48ml， 36.6g Tris，加雙蒸水到 80ml，調(diào)節(jié) pH到 8.9定容到 100ml。 儲備液 ： pH6.7 TrisHCl緩沖液： 1 M HCl 48ml， 5.98g Tri
4、s，加雙蒸水到 80ml，調(diào)節(jié) pH到 6.7 定容到 100ml。 儲備液： 分離膠儲備液（ 30% Acr/Bis）： 30g Acr， 0.8g Bis，用雙蒸水定容到 100ml，備用， 4 存放可以保存 1個月。 儲備液： 濃縮膠儲備液： 10g Acr， 2.5g Bis，用雙蒸水定容到 100ml，備用， 4 可以保存 1個月。 儲備液： 10% Aps（ W/V）： 1g定容到 10ml， -20 保存。 儲備液： 40%蔗糖： 40g蔗糖溶解到 60ml雙蒸水中。 TEMED 2.電泳緩沖液： Tris6.0g， 28.8gGly 加雙蒸水到 900ml調(diào)節(jié) pH到 8.3，
5、定容到 1000ml，使用時稀釋 10倍。 樣品制備 取材： 大黃魚若干條，解剖取 1.腸、 2.眼睛、 3.鰓、 4.肌 肉、 5.脾、 6.鰭、 7.肝、 8.心臟 放入冰箱保存。 提取酶：取不同組織塊，加入提取緩沖液 Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需 預(yù)冷，組織重量（ g）與緩沖液體積（ mL）之 比為： 5,用研缽研磨充分。漿液 離心約分鐘， 轉(zhuǎn)分鐘。 取上清液至新管，吸取其中 150ul樣品，加 ul 甘油 和 ul溴酚藍(lán)，混勻之后即可點(diǎn)樣。 分離膠的制備 將需要的凝膠儲備液從冰箱中取出，放置備 用。取一 100ml燒杯，按表比例混勻之后 使用。 儲備液 A儲備液 C儲備液
6、 E儲備液 雙蒸水 TEMED 總體積 用量（ ml） 2.5 3.75 0.1 13.75 10ul 20 配方表 濃縮膠的制備 TEMED最后一個加入，輕輕混勻。移液槍吸取加入約 2.0CM左右高度 的濃縮膠液，然后插入樣品梳，注意不要產(chǎn)生氣泡。當(dāng)濃縮膠上出現(xiàn)水 層后表明聚合完成。再放置 30 60min后可以使用。 加入少量電泳緩沖液，小心拔出樣品梳（兩端同時向外拔），再注滿緩 沖液備用。 儲備液 B儲備 液 D儲備 液 E儲備 液 F儲備 液 雙蒸水 TEMED 總體積 用量 （ ml） 1.25 0.8 60ul 5 2.9 16ul 10 配方表 點(diǎn)樣 加樣 樣品遷 移方向 電 泳
7、 電壓和電流：濃縮膠電壓 100v，分離膠電壓 180V. 電流流 18 30mA 溴酚藍(lán)跑至分離膠末端，電泳結(jié)束。大約 2-3個小時 夾在兩塊玻璃 板之間的凝膠 電泳 緩沖液 電泳 緩沖液 加在槽中的樣品 分子量小 分子量大 電源 電 泳 示 意 圖 電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分 子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。 混合樣品 帶孔膠 按分子 大小分離 電泳方向 電泳 小分子 大分子 乳酸脫氫酶染色劑的配制 乳酸鈉 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M Tris Hcl溶液（ PH8.0） 10ml 去離子水定容至 50ml 染色與觀察 將膠從中間切成 2塊，各自切去一個小 角（作為標(biāo)記），去離子水輕輕從玻 璃板上吹下， 置于大培養(yǎng)皿中，去離子水浸洗之后 倒入染 染色劑浸沒，避光于 37度搖床中染色 30min。 觀察拍照 思考題： 根據(jù)實(shí)驗過程的體會，總結(jié)如何做好 聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳？哪些是 關(guān)鍵步驟？哪些過程中是 為什么要在樣品中加入少許溴酚藍(lán)和 甘油溶液？分別有何用途？ 謝謝
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