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1、掃描電鏡樣品的制做與觀察 解放軍總醫(yī)院骨科研究所 黃靖香 目的 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展興起，如支架材料 的制作后，需觀察樣品中的孔徑大小 ，與細(xì) 胞的相融性，生長形態(tài)變化等。用掃描電鏡 觀察獲得清晰圖像，是重要的檢測手段之一。 電子顯微鏡分透射和掃描電鏡兩種，透射電 鏡（ TEM）是觀察樣品中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)：如細(xì) 胞器等；掃描電鏡（ SEM）可觀察樣品中的 表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。 掃描電鏡的優(yōu)點 景深長，視野廣，圖像呈三維立體結(jié)構(gòu)，樣 品制作較透射電子顯微鏡簡單，功能多，根 據(jù)樣品性質(zhì)不同，其處理方法也有所區(qū)別， 下面主要介紹組織工程支架、細(xì)胞、細(xì)胞外 基質(zhì)等樣品
2、的制作技術(shù)。 一 . 樣品制作處理步聚 取樣 清洗 第一次固定（戊二醛） 第二 次固定（鋨酸） 緩沖液中漂洗 梯度脫水 醋酸戊酯置換 臨界點干燥（改成六甲基 二硅胺烷 HMDS代替臨界點干燥） 表面噴 鍍 掃描電鏡中觀察。根椐我們的具體情況 加以改進(jìn)。 1. 材料準(zhǔn)備、液體配制： 1）玻璃器皿需泡酸、蒸溜水清冼后滅菌備用。 2）磷酸緩沖液（ PBS-0.1M PH-7.4）配制：磷 酸二氫鈉 2.964g , 磷酸氫二鈉 29.011g加三蒸水 1000ml，也可用不加酚紅無菌 Dhankes液代替。 3）固定液的配制：用 PBS緩沖液配成 2.5%
3、戍 二醛和 1%的四氧化鋨。 2. 取材準(zhǔn)確、固定及時：盡可能保存原貌， 大小適宜（ 10mm2高 5mm左右），對樣品表面 用無菌 Dhankes液清洗 2次，迅速用 2.5%戍二 醛 4度下前固定 4h以上。 3. 觀察樣品前兩天， PBS洗 20分鐘 /次 2次， 以下均在室溫下，通風(fēng)櫥中進(jìn)行。 4 1%四氧化鋨酸后固定 2h。 缺插圖 托上加圖片 餓酸固定加圖片 單寧酸 加圖片 5重復(fù)步驟 3。 6. 2%單寧酸過濾后洗 2次，每次 30min。 7重復(fù)步驟 3。 8. 梯度乙醇脫水（ 50 75 90 100） % 2次， 每 次 30mi
4、n，也可在 75或 90%乙醇中過夜。 9. 醋酸異戊酯置換乙醇 40min。 10. 六甲基二硅胺烷原液（ HMDS） 5-10min替 代臨界點干燥，放青霉素瓶中抽真空后密 封。 11. 樣品用導(dǎo)電膠貼牢貼平，正面朝上，大小 適宜。置蒸空干燥器內(nèi)過夜。 12. 第三天早晨，用離子濺射真空鍍膜法噴鍍 導(dǎo)電金屬。 13. 上機(jī)觀察樣品，照相獲得二次電子圖像。 二 . 比較不同干燥方法的優(yōu)缺點 材料分類 A 單純支架材料：看孔隙率和孔徑大小分布，用普通冷凍 干燥機(jī)冷凍干燥法干燥 48h的支架 粘貼后 噴金上機(jī)觀 看
5、 干燥噴鍍上機(jī)觀察 B.活細(xì)胞不處理環(huán)鏡掃描直觀看細(xì)胞 活細(xì)胞環(huán)鏡掃描圖 C. 細(xì)胞常規(guī)梯度脫水：用冷凍干燥機(jī)處理 細(xì) 胞收縮，斷裂，立體感差。 冷凍干燥細(xì)胞裂縫 冷凍干燥細(xì)胞收縮 D. HMDS法替代臨界點干燥 :處理細(xì)胞加支架 HMDS處理后的圖像 E. HMDS法替代臨界點干燥 :處理細(xì)胞加支架 微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察：納米材料 (ECM) 豬 E
6、CM膠原 犬神經(jīng)膠原 臍帶 ECM膠原 背根神經(jīng)節(jié)基質(zhì) F. 常規(guī)脫水臨界點干燥處理后的樣品和六甲 基 =硅胺烷（ HMDS）處理的比較 常規(guī)處理 HMDS處理 三 注意事項和要求 1. 取材大小適宜，準(zhǔn)確定位，首先洗去贅生物 后立即固定，防組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)自溶或變形。 污染物造成圖像表面出現(xiàn)絮狀物，輪廓不清。 2. 根據(jù)不同樣品，采用不同的干燥方法，防止 因干燥時間過長，壓力過大造成樣品過度收縮 和斷裂。樣品厚而貼不牢不平，造成噴鍍不均， 樣品邊緣空白，發(fā)亮而出現(xiàn)充電現(xiàn)象和邊緣效
7、應(yīng)。圖像漂移。為此可降低電壓（ 1-5 KV）減 少充電和邊緣效應(yīng)。 3. 用單寧酸的目的為提高二次電子發(fā)射率，耐 受電子轟擊，防止樣品斷裂。 4. 樣品脫水干燥貼牢后，需放置玻璃密封真空（加干 燥劑）干燥器皿內(nèi)。樣品噴鍍后，最好當(dāng)天觀察， 照相 ,如看不完，還需放干燥器中密封真空保存，防 灰塵潮氣進(jìn)入。最好勿超過 3個月。 5. 因條件有限，無臨界點干燥儀，我們采用六甲基二 胺烷（ HMDS）代替臨界點干燥儀，優(yōu)點是快速經(jīng) 濟(jì)，不受儀器限制，看普通標(biāo)本，組織細(xì)胞支架材 料，與常規(guī)臨界點干燥處理效果基本一致；看精細(xì) 材料（ ECM）的分辨率還是有差距。 6. 膠原纖維樣品梯度脫水前的漂洗液我們采用無菌的 三蒸水洗 2次，防止鹽結(jié)晶沉積在樣品表面，影響 與超微納米膠原的混淆。
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