《內含子的比較》PPT課件

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1、8.5 不同類型內含子的比較,8.5.1.1 型內含子,概念: ：1980年代初，發(fā)現原生動物四膜蟲 (Tetruhymenu) 的rRNA內含子能夠自我剪接(self splicing)，這一類內含子后被稱作型內含子.后來在酵母菌的線粒體rRNA基因中也含有此類內含子.,發(fā)現過程為: 1980年,科學工作者將四膜蟲rRNA基因克隆到質粒中，并與E.coli 的RNA聚合酶一起保溫，發(fā)現轉錄產物除了有約400nt的rRNA內含子外，還有一些小片段。從凝膠中回收rRNA前體，在無蛋白質的條件下保溫培養(yǎng)，單一的rRNA前體依然可形成片段更小的電泳條帶，其中移動最快的是39nt的條帶，測序發(fā)現，它

2、相當于413nt的rRNA內含子中的片段。將四膜蟲26S rRNA基因的一部分(第l個外顯子303bp + 完整的內含子413bp + 第2個外顯子624bp)克隆到含噬菌體SP6啟動子的載體內，再轉錄該重組質粒，將獲得的產物與 GTP一起保溫，可以得到剪接產物，但缺乏GTP時無剪接反應，證明rRNA前體的確可以進行有GTP參與的自我剪接。,8.5.1.2 型內含子的剪接機制,(1) I型內含子剪接的過程 I型內含子剪接的第一次轉酯反應，是由一個游離的鳥苷或鳥苷酸(GMP, GDP或GTP)啟動的。鳥苷酸或鳥苷的3-OH親核攻擊內含子5-端剪接點的磷酸二酯鍵，將G轉移到內含子的5-端，同

3、時切割內含子與上游外顯子之間的磷酸二酯鍵，在上游外顯子末端產生新的3-OH。在第二次轉酯反應中，上游外顯子3-OH攻擊內含子3-端剪接點的磷酸二酯鍵，將上游外顯子和下游外顯子連接起來，并釋放線性的內含子。兩次轉酯反應是連續(xù)的，即外顯子連接和線性內含子的釋放同時進行。因此，實驗不能得到游離的上游外顯子和下游外顯子。,第三次轉酯反應是線性內含子的環(huán)化，發(fā)生在已切除的內含子片段中，內含子的3-OH攻擊其5-端附近的第15和第16核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從5-端切除15nt的片段，并形成399nt的環(huán)狀RNA。環(huán)狀RNA隨即被切割生成線狀RNA，由于切割位置與環(huán)化位置相同，生成的線狀RNA依然為399

4、nt。接著，再從5-端切去4個核苷酸，最終產物是395nt的線性RNA，由于這一產物比最初釋放的內含子少19個核苷酸，因而被稱作L19。,(2) I型內含子的結構 I型內含子剪接的最重要特點是自我催化(self-catalysis)，I型內含子的自我剪接活性依賴于RNA分子中的堿基配對。通過比較不同的I型內含子序列，發(fā)現其中有9個主要的堿基配對區(qū)域，命名為P1P9，在I型內含子中高度保守的雙鏈結構有3個，即P1的內部引導序列(internal guide sequence, IGS)，P4的保守短序列元件P/Q，和P7的保守短序列元件S/R，其他配對區(qū)的序列因內含子不同而異。I型內含子自我剪接

5、所需的最小催化活性中心由P3、P4、P6和P7組成。該結構包括由兩個結構域構成的催化核心，每個結構域由兩個堿基配對區(qū)域構成。包含上游外顯子末端序列和內含子端IGS的P1，構成底物結合位點，IGS是內含子中能與外顯子進行堿基配對的序列，這種配對使剪接位點暴露而易受攻擊，同時使剪接反應具有專一性(圖8-16)。,,I型內含子的特征 1.邊界順序為5UG 3; 2.具有中部核心結構（Central core structure); 3.內部引導順序(Internal guide seguence IGS); 4.剪接通過轉酯反應（Transesterification).,8.5.2.1 II型內含

6、子的特點 II型內含子主要存在于某些真核生物的線粒體和葉綠體rRNA基因中，也具有催化功能，能夠完成自我剪接.幾乎所有的細菌II型內含子能夠編碼逆轉錄酶，并可作為逆轉錄轉座子，或逆轉錄轉座子的衍生物高頻率插入特定區(qū)域，或低頻率插入其它區(qū)域。II型內含子是由內含子靠近3-端的腺苷酸2-羥基攻擊5-磷酸基啟動剪接過程，經過兩次轉酯反應連接兩個外顯子，并切除形成套索結構的內含子(圖8-17)。,8.5.2.2 II型內含子的剪接機制,II型內含子的5-端和3-端剪接位點序列為5GUGCGYnAG3，符合GUAG規(guī)則。II型內含子的空間結構保守而復雜，其自我剪接的活性有賴于其二級結構和進一步折疊的

7、構象，因此在細胞內的存在受到限制。在II型內含子特有的二級結構中，有6個莖環(huán)結構形成的結構域(dld6)，在空間上靠近的d5和d6，構成催化作用的活性中心(圖8-18)。,在II型內含子剪接過程中，首先由內含子靠近3-端d6結構中的分支點保守序列上A的2-OH向5-剪接位點的磷酸二酯鍵發(fā)動親核攻擊，形成外顯子1的3-OH，內含子5-端的磷酸基與分支點A的2-OH基形成2, 5-磷酸二酯鍵，產生套索結構，完成第一次轉酯反應。接著，外顯子1的3-OH親核攻擊3-剪接位點，切斷3-剪接位點的磷酸二酯鍵，并形成外顯子1與外顯子2之間的3, 5-磷酸二酯鍵，完成第二次轉酯反應。經過兩次轉酯反應，兩個外顯

8、子被連接在一起，并釋放含有套索結構的內含子。,II型內含子主要的轉座事件是歸巢(homing)，歸巢的實質是以內含子RNA作為模板，將逆轉錄合成的DNA插入靶位點。逆轉錄反應由與RNA內含子結合的RT催化，屬于靶位點為引物的逆轉錄(target-primed reverse transcription)。如圖8-20所示，歸巢反應開始于雙鏈DNA外顯子連接點上RNA內含子在靶位點的反拼接(reverse splicing)插入，這一步由RNA催化，RT協(xié)助，相當于由成熟酶協(xié)助的拼接反應的逆反應。隨后，RT的En結構域在下游9 bp10 bp的位置切開DNA的另一條鏈，再由RT催化，以被切開的D

9、NA鏈作為引物進行逆轉錄反應。最后，通過DNA的修復合成和連接完成內含子的插入過程。,Splicing releases a mitochondrial group II intron in the form of a stable lariat.,8.5.3 內含子剪接機制的比較,從內含子的剪接機制來看，I型內含子、II型內含子和核pre-mRNA剪接的III型內含子是相似的，只有tRNA的IV型內含子剪接機制完全不同。 I型內含子剪接與核Pre-mRNA剪接體切除內含子的主要區(qū)別是，剪接體內含子使用內含子自身的一個核苷酸，而I型內含子的剪接反應使用外源核苷酸，即鳥苷酸或鳥苷，因此在剪接過程

10、中不能形成套索結構。 III型內含子的剪接體內snRNA的整體形態(tài)和II型內含子自我剪接時的形態(tài)類似，特別是剪接體的snRNA和II型內含子的催化部位之間的結構和功能十分相似?？梢哉J為，這些snRNA可能來自早期自我剪接系統(tǒng)的II型內含子,I型內含子與II型內含子都能夠完成自我剪接，不像III型內含子那樣需要結構復雜的剪接體。正因為如此，I型內含子與II型內含子剪接的效率和調控遠遠比不上III型內含子。I型內含子的剪接反應使用外源鳥苷酸或鳥苷，II型內含子的轉酯反應無需游離鳥苷酸或鳥苷的啟動，由內含子內部的腺苷酸引起，也許II型內含子剪接的效率和精確度比I型內含子更好一些。,8.6 核酶,8.

11、6.1 核酶的發(fā)現 1982年Cech等研究原生動物嗜熱四膜蟲rRNA的轉錄后加工，發(fā)現rRNA的前體可以在鳥苷與鎂離子存在下切除自身的內含子，將兩個外顯子拼接為成熟的rRNA分子，該反應不需要任何蛋白質類型的酶參與，因此Cech認為該rRNA前體具有催化功能，并將其命名為核酶(ribozyme). Cech和Altman因發(fā)現Ribozyme而獲得1989年度諾貝爾化學獎。,,1985年Cech等通過進一步研究，從切除的內含子中分離得到L19RNA，可參與如轉核苷酸反應、水解反應、轉磷酸反應等。L19RNA催化的轉核苷酸反應如圖8-21所示，可以看出，L19RNA既可從寡聚C切除核苷酸

12、(圖8-21和)，也可在寡聚C上添加核苷酸(圖8-21和)，其催化過程具備酶的所有基本特征。,,核酶作用的特點： 1，化學本質 RNA 2，底物 RNA 肽鍵-葡聚糖分子酶 3，反應特異性 4，催化效率低 5，產物,,Reactions catalyzed by RNA have the same features as those catalyzed by proteins, although the rate is slower. The Km gives the concentration of substrate required for half-maximum velocity;

13、this is an inverse measure of the affinity of the enzyme for substrate. The turnover number gives the number of substrate molecules transformed in unit time by a single catalytic site.,核酶的分類,8.6.3 核酶的結構 核酶的催化功能與其空間結構密切相關，已知有多種不同結構的核酶。例如，I型和II型自我剪接內含子、錘頭型、RNaseP的Ml RNA、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒(hepatitis delta v

14、irus, HDV)的基因組和反基因組等。錘頭型、發(fā)夾型和HDV正負鏈核酶均能促使自身或底物RNA裂解，產生2, 3-環(huán)磷酸酯和5-OH,,錘頭結構(hammerhead structure)。錘頭結構包含3個莖環(huán)區(qū)以及13個保守核苷酸構成的催化中心，可以由一條RNA鏈回折形成(圖8-22a)，也可由底物鏈和催化鏈共同構成(圖8-22b)，兩種形式的錘頭結構都可構成如圖8-22c所示的空間結構，即酶的活性中心。事實上無論自我剪切型的核酶，或者酶與底物RNA之間，只要能形成錘頭二級結構，并具備1113nt的保守序列，就能在錘頭結構GUN序列的3-端自動發(fā)生剪切反應。,核酶的活性部位是暴露在分子表面的一段保守核苷酸區(qū)域，無論RNA分子形成的是二級或三級結構，都使得這個區(qū)域保持一種特定的分子環(huán)境，能使自身RNA分子斷裂，或者使另一底物分子的磷酸二酯鍵斷裂，或在切割一個磷酸二酯鍵的同時，形成另一個新的磷酸二酯鍵。核酶RNA與底物RNA之間的相互作用依賴于堿基配對，形成一種催化環(huán)境。,核酶是一種金屬離子依賴酶,金屬離子的結作用： 特異的結構作用或參與活性部位的化學過程 促進RNA整體折疊 二價金屬離子（Mg2+)與底物活性部位直接相互作用或參與過渡中間復合物的產生,