2014年高考生物大一輪復(fù)習(xí) 第十單元 第37講 基因工程教案

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1、2014年高考生物大一輪復(fù)習(xí) 第十單元 第37講 基因工程教案 1. 涵蓋范圍 本單元包括選修3全部?jī)?nèi)容——基因工程、細(xì)胞工程、胚胎工程、生物技術(shù)的安全性和倫理問題以及生態(tài)工程。 2. 考情分析 (1)考查力度:占分比重相對(duì)穩(wěn)定,如山東理綜只出一個(gè)8分的簡(jiǎn)答題。 (2)考查內(nèi)容 ①基因工程中三種工具。 ②基因工程操作四步曲。 ③基因工程成果——轉(zhuǎn)基因生物實(shí)例及安全性討論。 ④細(xì)胞工程中植物組織培養(yǎng)、植物體細(xì)胞雜交。 ⑤動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和單克隆抗體的制備及應(yīng)用。 ⑥核移植技術(shù)。 ⑦胚胎工程中胚胎移植和胚胎分割。 ⑧干細(xì)胞的研究。 (3)考查形式 ①有的省將選修與必修有機(jī)

2、結(jié)合,既可出簡(jiǎn)答題也可出選擇題。 ②有的省如山東省全部以簡(jiǎn)答題形式呈現(xiàn),且不與必修聯(lián)系。 3. 復(fù)習(xí)指導(dǎo) (1)復(fù)習(xí)線索 ①以基因工程的具體成果(如抗蟲棉)為主線,系統(tǒng)復(fù)習(xí)基因工程的操作工具和操作步驟等知識(shí)點(diǎn)。 ②以植物的組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ),系統(tǒng)復(fù)習(xí)其他細(xì)胞工程技術(shù)手段。 ③以體內(nèi)受精作用和個(gè)體發(fā)育過程為基礎(chǔ),系統(tǒng)復(fù)習(xí)胚胎工程的流程。 (2)復(fù)習(xí)方法 ①圖解法復(fù)習(xí)基因工程和胚胎工程。 ②比較法復(fù)習(xí)植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng);植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合及單克隆抗體制備。 ③關(guān)注熱點(diǎn)科研成果,注意知識(shí)的實(shí)踐應(yīng)用。 第37講 基因工程 [考綱要求] 1.基因工程的

3、誕生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技術(shù)(Ⅱ)。3.基因工程的應(yīng)用(Ⅱ)。4.蛋白質(zhì)工程(Ⅰ)。 考點(diǎn)一 聚焦基因工程的概念及基本工具 1. 分析基因工程的概念 (1)供體:提供目的基因。 (2)操作環(huán)境:體外。 (3)操作水平:分子水平。 (4)原理:基因重組。 (5)受體:表達(dá)目的基因。 (6)本質(zhì):性狀在受體體內(nèi)表達(dá)。 (7)優(yōu)點(diǎn):克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙,定向改造生物的遺傳性狀。 2. 基因工程的基本工具(判一判) (1)限制酶只能用于切割目的基因 ( × ) (2)限制酶切割DNA分子具有特異性 ( √ ) (3)限制

4、酶切割DNA分子后可產(chǎn)生黏性末端和平末端兩種類型 ( √ ) (4)DNA連接酶能將兩堿基間通過形成氫鍵連接起來 ( × ) (5)E·coli DNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端 ( × ) (6)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子,是基因工程常用的載體 ( √ ) (7)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中,使之穩(wěn)定存在并表達(dá) ( √ ) 易錯(cuò)警示 巧辨基因工程操作工具的8個(gè)易錯(cuò)點(diǎn) (1)限制酶是一類酶,而不是一種酶。 (2)限制酶的成分為蛋白質(zhì),其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件,高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。 (3)在切割目的基因和

5、載體時(shí)要求用同一種限制酶,目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。 (4)將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來,需要切兩處,同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)黏性末端。 (5)不同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同,同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割,產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外,不能破壞標(biāo)記基因,以便于進(jìn)行檢測(cè)。 (7)基因工程中的載體與細(xì)胞膜上物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體不同?;蚬こ讨械妮d體是DNA分子,能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi);膜載體是蛋白質(zhì),與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。 (8)基因工程中有3種工具,但工具酶只有2種。 1. 如圖所示為部分雙鏈DNA片段,下列有關(guān)基因工程中工

6、具酶功能的敘述錯(cuò)誤的是 (  ) A.切斷a處的酶為限制酶 B.連接a處的酶為DNA連接酶 C.切斷b處的酶為DNA解旋酶 D.連接b處的酶為RNA聚合酶 答案 D 解析 限制酶能識(shí)別特定的核苷酸序列,并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子,通常形成黏性末端,即能切割DNA鏈外側(cè)的磷酸二酯鍵(圖中的a處),內(nèi)側(cè)堿基對(duì)之間的氫鍵(b處)可通過DNA解旋酶水解。DNA連接酶將切斷的磷酸二酯鍵進(jìn)行連接,即圖中的a處。RNA聚合酶的作用是催化DNA的轉(zhuǎn)錄。 2. 限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示四種質(zhì)粒和目

7、的基因,其中,箭頭所指部位為限制酶的識(shí)別位點(diǎn),質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是 (  ) 答案 A 解析 由圖可知,質(zhì)粒B上無標(biāo)記基因,不適合作為載體;質(zhì)粒C和D的標(biāo)記基因上都有限制酶的識(shí)別位點(diǎn);只有質(zhì)粒A上既有標(biāo)記基因,且MunⅠ的切割位點(diǎn)不在標(biāo)記基因上。 1. 與DNA有關(guān)的酶 (1)五種相關(guān)酶的比較 作用底物 作用部位 形成產(chǎn)物 限制酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 黏性末端或平末端 DNA連接酶 DNA片段 磷酸二酯鍵 重組DNA分子 DNA聚合酶 脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵 子代DNA DNA解旋酶 DNA分

8、子 堿基對(duì)間 的氫鍵 形成脫氧核苷酸單鏈 DNA(水解)酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 游離的脫氧核苷酸 (2)限制酶和DNA連接酶之間的關(guān)系圖示 2. 對(duì)載體的分析 條 件 目 的 穩(wěn)定并能復(fù)制 目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大 有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn) 可攜帶多個(gè)或多種外源基因 具有特殊的標(biāo)記基因 便于重組DNA的鑒定和選擇 考點(diǎn)二 基因工程的操作步驟 觀察基因工程的操作過程,分析每一步驟的操作程序 (1) 獲取目的基因—   (2) 基因表達(dá)載體的構(gòu)建—組成   (3) 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞—方法 (4)

9、目的基因的檢測(cè)與鑒定 易錯(cuò)警示 基因工程操作的8個(gè)易錯(cuò)點(diǎn) (1)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的 基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控,所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。 (2)基因工程操作過程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)沒有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象 第一步存在逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA,第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象,第四步檢測(cè)存在分子水平雜交方法。 (3)原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn):繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。 (4)一般情況下,用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的片段,但有時(shí)可用兩種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因,這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。

10、 (5)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。 (6)不熟悉標(biāo)記基因的種類和作用:標(biāo)記基因的作用——篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞,常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。 (7)對(duì)受體細(xì)胞模糊不清:受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞(經(jīng)組織培養(yǎng))、動(dòng)物受精卵(一般不用體細(xì)胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌);一般不用支原體,原因是它營(yíng)寄生生活;一定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞,原因是它無細(xì)胞核,不

11、能合成蛋白質(zhì)。 (8)還應(yīng)注意的問題有:①基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子(DNA片段)≠起始密碼子(RNA);終止子(DNA片段)≠終止密碼子(RNA)。②基因表達(dá)載體的構(gòu)建是最核心、最關(guān)鍵的一步,在體外進(jìn)行。 3. 下列有關(guān)基因工程操作的敘述中,正確的是 (  ) A.用同種限制酶切割載體與目的基因可獲得相同的黏性末端 B.以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因的堿基序列相同 C.檢測(cè)到受體細(xì)胞含有目的基因就標(biāo)志著基因工程操作的成功 D.用含抗生素抗性基因的質(zhì)粒作為載體是因?yàn)槠淇剐曰虮阌谂c外源基因連接 答案 A 解析 一種氨基酸可以由多種密碼子控制,因此

12、以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因通常不同;只有目的基因表達(dá),使受體表現(xiàn)出目標(biāo)性狀或獲得目標(biāo)產(chǎn)物才標(biāo)志著基因工程操作的成功;抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因,用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。 4. 浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻景權(quán)教授課題組研究發(fā)現(xiàn),一種植物激素——油菜素內(nèi)酯能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝。用油菜素內(nèi)酯處理后,許多參與農(nóng)藥降解的基因(如P450基因和紅霉素抗性基因)的表達(dá)和酶活性都得到提高,在這些基因“指導(dǎo)”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒甚至無毒物質(zhì),有的則被直接排出體外。某課題組進(jìn)一步進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)操作,請(qǐng)回答下列問題: (1)獲得油菜素內(nèi)酯合成酶

13、基因的方法有____________________________________。步驟①用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因時(shí)用到的耐高溫酶通常是指______________________________;步驟②用到的酶有___________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)圖中導(dǎo)入重組質(zhì)粒的方法是____________,在導(dǎo)入之前應(yīng)用一定濃度的_________________

14、_處理受體細(xì)菌。 (3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒2以后,往往還需要進(jìn)行檢測(cè)和篩選,可用____________________制成探針,檢測(cè)是否導(dǎo)入了重組基因,在培養(yǎng)基中加入________________可將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。 (4)請(qǐng)你為該課題命名:____________________________________________________。 答案 (1)從cDNA文庫中獲取、從基因組文庫中獲取、人工合成目的基因或PCR擴(kuò)增技術(shù)(任選其中兩項(xiàng)即可) TaqDNA聚合酶 限制酶和DNA連接酶 (2)轉(zhuǎn)化法 氯化鈣溶液 (3)紅霉素抗性基因 紅霉素 (4)探究油菜素內(nèi)酯能

15、否促進(jìn)土壤中農(nóng)藥的分解 解析 進(jìn)行基因工程操作時(shí),首先要獲取目的基因,其方法有多種:從cDNA文庫中獲取、從基因組文庫中獲取、人工合成目的基因或PCR擴(kuò)增技術(shù)等。在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中,用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶。圖中的受體細(xì)胞是細(xì)菌,故用轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入基因表達(dá)載體,導(dǎo)入后,需檢驗(yàn)和篩選。從圖中可以看出,最終是通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌對(duì)土壤中殘留農(nóng)藥的分解能力。 1. 獲取目的基因 (1)直接分離 (2)人工化學(xué)合成:適用于分子較小的基因。 2. 基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心 (1)目的:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時(shí),使目的基因

16、能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 (2) 基因表達(dá)載體組成 (3)構(gòu)建過程 3. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 生物種類 植物 動(dòng)物 微生物 常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞法 受體細(xì)胞 體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過程 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA上→表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物 Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 4. 目的基因的檢測(cè)與鑒定 考點(diǎn)三 關(guān)注基因工程

17、的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程 1. 基因工程的應(yīng)用(判一判) (1)我國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉轉(zhuǎn)入的抗蟲基因是Bt毒蛋白基因 ( √ ) (2)利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品,如人的血清白蛋白,這是因?yàn)閷⑷说难灏椎鞍谆驅(qū)肓藙?dòng)物的乳腺細(xì)胞中 ( × ) (3)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應(yīng)用 ( × ) (4)為培育抗除草劑的作物新品種,導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體 ( × ) (5)目前,植物基因工程技術(shù)主要應(yīng)用于提高農(nóng)作物的抗逆性、生產(chǎn)某些天然藥物、改良農(nóng)作物的品質(zhì)、作器官移植的供體 ( × ) (6)基因

18、工程藥物主要來源于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn) ( × ) (7)基因治療是把正?;?qū)氩∪梭w內(nèi),使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能,從而達(dá)到治療疾病的目的 ( √ ) 2. 蛋白質(zhì)工程 (1)概念理解 ①基礎(chǔ):蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。 ②操作:基因修飾或基因合成。 ③結(jié)果:改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出新的蛋白質(zhì)。 ④目的:滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。 (2)操作過程:從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)→基因表達(dá)→產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。 易錯(cuò)警示 (1)有關(guān)基因工程應(yīng)用的易錯(cuò)點(diǎn)

19、:①動(dòng)物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì),而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個(gè)體。②DNA分子作探針進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)檢測(cè)單鏈,即將待測(cè)雙鏈DNA分子打開。③Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無毒性,進(jìn)入昆蟲消化道被分解成多肽后產(chǎn)生毒性。④青霉素是青霉菌產(chǎn)生的,不是通過基因工程產(chǎn)生的。⑤并非所有個(gè)體都可作為乳腺生物反應(yīng)器。操作成功的應(yīng)該是雌性個(gè)體,個(gè)體本身的繁殖速度較高,泌乳量、蛋白含量等都是應(yīng)該考慮的因素。⑥基因治療后,缺陷基因沒有改變。基因治療是把正?;?qū)胧荏w細(xì)胞中,以表達(dá)正常產(chǎn)物從而治療疾病,對(duì)原來細(xì)胞中存在缺陷的基因沒有清除或改變。(2)有關(guān)蛋白質(zhì)工程的易錯(cuò)點(diǎn):①對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造,其本質(zhì)是

20、改變其基因組成。如果對(duì)蛋白質(zhì)直接改造,即使改造成功,被改造的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳。②蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),創(chuàng)造新基因或者改造老基因,是基因工程的發(fā)展與延續(xù)。③蛋白質(zhì)工程與DNA分子重組技術(shù)是分不開的,常用到基因工程工具酶,如限制酶和DNA連接酶。 5. 科學(xué)家利用基因工程技術(shù)可以使哺乳動(dòng)物本身變成“批量生產(chǎn)藥物的工廠”。目前科學(xué)家已在牛和羊等動(dòng)物的乳腺生物反應(yīng)器中表達(dá)出了抗凝血酶、血清白蛋白、生長(zhǎng)激素等重要藥品。請(qǐng)回答有關(guān)問題: (1)將藥用蛋白基因和乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子、終止子和______________等重組在一起,就可構(gòu)建基因表達(dá)載體,再通過__________

21、__技術(shù)即可導(dǎo)入受精卵中。 (2)制備乳腺生物反應(yīng)器的過程中,目的基因的受體細(xì)胞為____________,性染色體組成為________。 (3)為確定受體細(xì)胞中染色體的DNA上是否插入了目的基因,可利用____________技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),一般是用放射性同位素標(biāo)記________________________________作探針。 (4)轉(zhuǎn)化成功的受精卵發(fā)育成胚胎需要進(jìn)行體外培養(yǎng),在培養(yǎng)液中要加入____________等天然成分。 答案 (1)標(biāo)記基因 顯微注射 (2)受精卵 XX (3)DNA分子雜交 含有目的基因的DNA片段 (4)血清 解析 基因表達(dá)載體的組成,除了目

22、的基因,還必須有啟動(dòng)子、終止子及標(biāo)記基因。顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物操作中采用最多、也最有效的方法。制備乳腺生物反應(yīng)器的過程中,子代個(gè)體須有乳房,所以受體為雌性,其性染色體組成為XX。將含有目的基因的DNA片段用放射性同位素標(biāo)記作探針,用DNA分子雜交技術(shù)可檢測(cè)目的基因是否成功插入了受體細(xì)胞染色體的DNA上。 6. 胰島素可以用于治療糖尿病,但是胰島素被注射到人體后,會(huì)堆積在皮下,要經(jīng)過較長(zhǎng)的時(shí)間才能進(jìn)入血液,而進(jìn)入血液的胰島素又容易分解,因此,治療效果受到影響。如圖是用蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)速效胰島素的生產(chǎn)過程,請(qǐng)據(jù)圖回答有關(guān)問題: (1)構(gòu)建新的蛋白質(zhì)模型是蛋白質(zhì)工程的關(guān)鍵,圖中構(gòu)建新的胰島

23、素模型的主要依據(jù)是________________。 (2)通過DNA合成形成的新基因應(yīng)與____________結(jié)合后轉(zhuǎn)移到______________________中才能得到準(zhǔn)確表達(dá)。 (3)若要利用大腸桿菌生產(chǎn)速效胰島素,需用到的生物工程有____________、____________和發(fā)酵工程。 (4)圖中從胰島素模型到新的胰島素基因合成的基本思路是什么?___________________ __________________________________________________________________________________________

24、___________________________________。 答案 (1)蛋白質(zhì)的預(yù)期功能 (2)載體 大腸桿菌等受體細(xì)胞 (3)蛋白質(zhì)工程 基因工程 (4)根據(jù)新的胰島素中氨基酸的序列,推測(cè)出控制其合成的基因中的脫氧核苷酸序列,然后利用DNA合成儀合成出新的胰島素基因 解析 (1)蛋白質(zhì)工程首先要根據(jù)人們對(duì)蛋白質(zhì)功能的特定需求,對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計(jì),因此,圖中構(gòu)建新的胰島素模型的主要依據(jù)是預(yù)期胰島素的功能,即速效胰島素。(2)合成的目的基因應(yīng)與載體結(jié)合,構(gòu)建基因表達(dá)載體后導(dǎo)入受體細(xì)胞中才能表達(dá)。(3)利用蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)速效胰島素,需合成新的胰島素基因,改造好的目的基因需

25、要通過基因工程轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,并在生產(chǎn)中要借助工程菌,所以還需要發(fā)酵過程,因此,此過程涉及蛋白質(zhì)工程、基因工程、發(fā)酵工程。(4)由新的蛋白質(zhì)模型到構(gòu)建新的基因,其基本思路是根據(jù)新的胰島素中氨基酸的序列,推測(cè)出控制其合成的基因中的脫氧核苷酸序列,然后利用DNA合成儀來合成出新的胰島素基因。 1. 乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的比較 比較項(xiàng)目 乳腺生物反應(yīng)器 工程菌 基因結(jié)構(gòu) 動(dòng)物基因的結(jié)構(gòu)與人類基因的結(jié)構(gòu)基本相同 細(xì)菌或酵母菌等生物基因的結(jié)構(gòu)與人類基因的結(jié)構(gòu)有較大差異 基因表達(dá) 合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等,產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒有活性

26、 受體細(xì)胞 哺乳動(dòng)物的受精卵 微生物細(xì)胞 生產(chǎn)條件 不需嚴(yán)格滅菌,溫度等條件對(duì)其影響不大 需嚴(yán)格滅菌,需嚴(yán)格控制工程菌所需的外界條件 藥物提取 從動(dòng)物乳汁中提取 從微生物細(xì)胞中提取 2.基因治療與基因診斷 原理 操作過程 進(jìn)展 基因 治療 基因表達(dá) 把正?;?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中,以表達(dá)出正常性狀來治療 臨床實(shí)驗(yàn) 基因 診斷 堿基互補(bǔ)配對(duì) 制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合,分析雜交帶情況 臨床應(yīng)用 3. 基因工程與蛋白質(zhì)工程的比較 項(xiàng)目 蛋白質(zhì)工程 基因工程 區(qū)別 過程 預(yù)期蛋白質(zhì)的功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基

27、酸序列→推測(cè)相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列→合成DNA→表達(dá)出蛋白質(zhì) 獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定 實(shí)質(zhì) 定向改造或生產(chǎn)人類所需蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性,以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品 結(jié)果 生產(chǎn)自然界中沒有的蛋白質(zhì) 一般是生產(chǎn)自然界中已有的蛋白質(zhì) 聯(lián)系 蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程,因?yàn)閷?duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新的蛋白質(zhì),都必須通過基因修飾或基因合成實(shí)現(xiàn) 1. (2012·浙江卷,6)天然的玫瑰沒有藍(lán)色花,這是由于缺少控制藍(lán)色色素合成的基因B,而開藍(lán)色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B?,F(xiàn)用基因

28、工程技術(shù)培育藍(lán)玫瑰,下列操作正確的是 (  ) A.提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA,再擴(kuò)增基因B B.利用限制性核酸內(nèi)切酶從開藍(lán)色花矮牽牛的基因文庫中獲取基因B C.利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞 D.將基因B直接導(dǎo)入大腸桿菌,然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞 答案 A 解析 獲取目的基因B,可先提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的DNA,再經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增,A正確;基因文庫構(gòu)建時(shí)是將目的基因與載體連接起來,形成重組載體,再導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存和擴(kuò)增,提取目的基因時(shí)不需使用限制酶,B錯(cuò)誤;連接目的基因與質(zhì)粒的酶是DN

29、A連接酶,C錯(cuò)誤;將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,不使用大腸桿菌,D錯(cuò)誤。 2. (2011·浙江卷,6)將ada(腺苷酸脫氨酶基因)通過質(zhì)粒pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯(cuò)誤的是 (  ) A.每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞至少含一個(gè)重組質(zhì)粒 B.每個(gè)重組質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn) C.每個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少插入一個(gè)ada D.每個(gè)插入的ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子 答案 C 解析 大腸桿菌成功表達(dá)出腺苷酸脫氨酶,說明這些大腸桿菌都至少含一個(gè)重組質(zhì)粒,A項(xiàng)正確;作為載體的條件為至少含一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn),所以作

30、為載體的質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn),B項(xiàng)正確;作為基因表達(dá)載體應(yīng)包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因四部分,但并不是每個(gè)酶切位點(diǎn)都至少插入一個(gè)ada,C項(xiàng)錯(cuò)誤;由于這些目的基因成功表達(dá),所以每個(gè)ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子,D項(xiàng)正確。 3. (2012·新課標(biāo)全國(guó)卷,40)根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí),回答下列問題: (1)限制性內(nèi)切酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段,其末端類型有____________和____________。 (2)質(zhì)粒運(yùn)載體用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下: AATTC……G       G……CTTAA 為使運(yùn)載體與目的基因相連,含有目的基因的D

31、NA除可用EcoRⅠ切割外,還可用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割,該酶必須具有的特點(diǎn)是_________________________________ _______________________________________。 (3)按其來源不同,基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類,即__________DNA連接酶和__________DNA連接酶。 (4)反轉(zhuǎn)錄作用的模板是______________,產(chǎn)物是______________________。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,常采用____________技術(shù)。 (5)基因工程中除質(zhì)粒外,____________和__

32、__________也可作為載體。 (6)若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,一般情況下,不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞,原因是_____________________________________________________________。 答案 (1)黏性末端 平末端 (2)切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的末端相同(其他合理答案也可) (3)E·coli T4 (4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR (5)噬菌體 動(dòng)植物病毒(其他合理答案也可) (6)未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒(外源DNA)的能力極弱(其他合理答案也可) 解析 (1)DNA分子經(jīng)

33、限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端兩種類型。(2)為使運(yùn)載體與目的基因相連,應(yīng)使二者被切割后產(chǎn)生的末端相同,故用另一種限制酶切割產(chǎn)生的末端必須與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的末端相同。(3)根據(jù)酶的來源不同,DNA連接酶分為E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。(4)mRNA(或RNA)為模板,合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄,若要體外獲得大量DNA分子,可以使用RCR技術(shù)。(5)在基因工程中,通常利用質(zhì)粒作為運(yùn)載體,另外噬菌體和動(dòng)植物病毒也可作為運(yùn)載體。(6)大腸桿菌作為受體細(xì)胞時(shí),常用Ca2+處理,使之成為能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)細(xì)胞。 4. (2012·江蘇卷,32)

34、圖1表示含有目的基因D的DNA片段長(zhǎng)度(bp即堿基對(duì))和部分堿基序列,圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?,F(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶,它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。 請(qǐng)回答下列問題: (1)圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個(gè)堿基之間依次由______________________連接。 (2)若用限制酶SmaⅠ完全切割圖1中DNA片段,產(chǎn)生的末端是____________末端,其產(chǎn)物長(zhǎng)度為____________。 (3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T-A堿基對(duì)替換,那么基因D就突

35、變?yōu)榛騞。從雜合子中分離出圖1及其對(duì)應(yīng)的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,產(chǎn)物中共有____________種不同長(zhǎng)度的DNA片段。 (4)若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行連接,形成重組質(zhì)粒,那么應(yīng)選用的限制酶是____________。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后,為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌,一般需要用添加____________的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢測(cè),部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá),其最可能的原因是_________________________ ________________________________________________

36、_______________________________________________________________________。 答案 (1)脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖 (2)平 537 bp、790 bp、661 bp (3)4 (4)BamH Ⅰ 抗生素B 同種限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D與質(zhì)粒反向連接 解析 (1)一條脫氧核苷酸鏈中相鄰的兩個(gè)堿基之間是通過“—脫氧核糖—磷酸—脫氧核糖—”相連的,要注意兩條脫氧核苷酸鏈的相鄰堿基之間通過氫鍵相連進(jìn)行區(qū)分。(2)從SmaⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)可見,其切割后產(chǎn)生的是平末端,圖1中DNA片段有Sma Ⅰ的兩個(gè)識(shí)別序列

37、,故切割后產(chǎn)生的產(chǎn)物長(zhǎng)度為537(534+3)bp、790(796-3-3)bp和661(658+3)bp三種。(3)圖示方框內(nèi)發(fā)生堿基對(duì)的替換后,形成的d基因失去了1個(gè)Sma Ⅰ的識(shí)別序列,故D基因、d基因用Sma Ⅰ完全切割后產(chǎn)物中除原有的3種長(zhǎng)度的DNA片段外,還增加一種537+790 bp的DNA片段。(4)目的基因的兩端都有BamH Ⅰ的識(shí)別序列,質(zhì)粒的啟動(dòng)子后的抗生素A抗性基因上也有BamH Ⅰ的識(shí)別序列,故應(yīng)選用的限制酶是BamH Ⅰ,此時(shí)抗生素B抗性基因作為標(biāo)記基因,故篩選時(shí)培養(yǎng)基中要添加抗生素B。若重組質(zhì)粒已導(dǎo)入了受體細(xì)胞卻不能表達(dá),很可能是因?yàn)橛猛N限制酶切割后,目的基因和

38、質(zhì)粒有兩種連接方式,導(dǎo)入受體細(xì)胞的重組質(zhì)粒是目的基因和質(zhì)粒反向連接形成的。 1. 下列一般不作為基因工程中的標(biāo)記基因的是 (  ) A.四環(huán)素抗性基因 B.綠色熒光蛋白基因 C.產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因 D.貯藏蛋白的基因 答案 D 解析 標(biāo)記基因位于載體(質(zhì)粒)上,以利于重組DNA的鑒定和選擇,如四環(huán)素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。 2. 若要利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA(圖丙),限制酶的酶切位點(diǎn)分別是BglⅡ(AGATCT)、EcoRⅠ(GAATTC)和Sau3AⅠ(GATC)。下列分析合理的是

39、 (  ) A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體 答案 D 解析 解答本題的關(guān)鍵是要看準(zhǔn)切割后目的基因插入的方向,只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體,構(gòu)建的重組DNA中RNA聚合酶在插入的目的基因上的移動(dòng)方向才一定與圖丙相同。 3. 如圖表示利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得某種轉(zhuǎn)基因植物的部分操作步驟。以下說法錯(cuò)誤的是 (  ) A.利用含有四環(huán)素

40、的培養(yǎng)基可將含Ⅱ的細(xì)菌篩選出來 B.Ⅲ是農(nóng)桿菌,通過步驟③將目的基因?qū)胫仓? C.⑥可與多個(gè)核糖體結(jié)合,并可以同時(shí)翻譯出多種蛋白質(zhì) D.①過程的完成需要限制酶和DNA連接酶的參與 答案 C 解析?、奘且粋€(gè)mRNA分子,可與多個(gè)核糖體結(jié)合形成多聚核糖體,由于翻譯的模板是同一個(gè)mRNA分子,故翻譯出的是同一種蛋白質(zhì)。 4. 研究人員將魚的抗凍基因?qū)敕洋w內(nèi),獲得抗凍能力明顯提高的番茄新品種。下列操作合理的是 (  ) A.設(shè)計(jì)相應(yīng)DNA單鏈片段作為引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 B.利用限制酶和DNA聚合酶構(gòu)建基因表達(dá)載體 C.將基因表達(dá)載體導(dǎo)入番

41、茄細(xì)胞之前需用Ca2+處理細(xì)胞 D.運(yùn)用DNA分子雜交技術(shù)檢測(cè)抗凍基因是否在番茄細(xì)胞中表達(dá) 答案 A 解析 利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶構(gòu)建基因表達(dá)載體;將基因表達(dá)載體導(dǎo)入原核細(xì)胞之前需用Ca2+處理,番茄細(xì)胞為真核細(xì)胞;運(yùn)用抗原—抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)抗凍基因是否在番茄細(xì)胞中表達(dá)。 5. 如圖是從酵母菌中獲取某植物需要的某種酶的基因的流程,結(jié)合所學(xué)知識(shí)及相關(guān)信息回答下列問題: (1)圖中cDNA文庫________________基因組文庫(大于、等于、小于)。 (2)①過程提取的DNA需要____________的切割,B過程是____________過程。 (3)為在

42、短時(shí)間內(nèi)大量獲得目的基因,可用的技術(shù)是______________________,其原理是________________________________________________________________________。 (4)目的基因獲取之后,需要進(jìn)行____________________,其組成必須有_______________ _____________及標(biāo)記基因等,此步驟是基因工程的核心。 (5)將該目的基因?qū)肽畴p子葉植物細(xì)胞,常采用的方法是__________,其能否在此植物體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是________________,可以用__________

43、__________技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。 答案 (1)小于 (2)限制酶 逆轉(zhuǎn)錄 (3)PCR DNA復(fù)制 (4)基因表達(dá)載體的構(gòu)建 啟動(dòng)子、終止子、目的基因(復(fù)制原點(diǎn)可不答) (5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 目的基因是否整合到植物細(xì)胞的染色體上 DNA分子雜交 解析 (1)基因組文庫是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段克隆到某種載體上形成的集合;cDNA文庫是由mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的基因組成的,由于基因的選擇性表達(dá),cDNA文庫小于基因組文庫。(2)從供體細(xì)胞的DNA中獲取目的基因,首先應(yīng)用限制酶將目的基因從其所在的DNA分子上切割下來;B過程是以mRNA為模板合成DNA的過程,

44、應(yīng)為逆轉(zhuǎn)錄過程。(3)PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增DNA的方法,其原理為DNA復(fù)制,能將得到的目的基因在細(xì)胞外大量擴(kuò)增。(4)基因表達(dá)載體包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子,其構(gòu)建是基因工程的核心。(5)將目的基因?qū)肽畴p子葉植物細(xì)胞常采用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,目的基因只有整合到植物細(xì)胞的染色體上才能在植物體內(nèi)穩(wěn)定遺傳,可通過DNA分子雜交的方法對(duì)目的基因是否整合到染色體上進(jìn)行檢測(cè)。 6. 在某些深海魚中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對(duì)提高農(nóng)作物的抗寒能力有較好的應(yīng)用價(jià)值。如圖所示是獲得轉(zhuǎn)基因萵苣的技術(shù)流程,請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題: (1)獲取目的基因的主要途徑包括從自然界已有的物種中分離和__

45、________。 (2)①過程需要的酶有____________、____________________。 (3)重組質(zhì)粒除了帶有抗凍蛋白基因afp,還必須含有啟動(dòng)子、終止子和____________,這樣才能構(gòu)成一個(gè)完整的基因表達(dá)載體。 (4)如果受體細(xì)胞C1是土壤農(nóng)桿菌,則將目的基因?qū)胨哪康氖抢棉r(nóng)桿菌的______________,使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞C2,并將其插入到受體細(xì)胞C2中______________________上,使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá),形成轉(zhuǎn)基因萵苣。經(jīng)②過程獲得的轉(zhuǎn)基因萵苣中的目的基因是否表達(dá),在分子水平上可用____________法

46、進(jìn)行檢測(cè),如果出現(xiàn)雜交帶,說明目的基因已經(jīng)表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)品,轉(zhuǎn)基因萵苣培育成功。 答案 (1)(用逆轉(zhuǎn)錄等方法進(jìn)行)人工合成 (2)限制酶 DNA連接酶 (3)標(biāo)記基因 (4)轉(zhuǎn)化作用 染色體的DNA 抗原—抗體雜交 解析 (1)獲取目的基因的主要途徑有從自然界已有的物種中分離和人工合成。(2)①過程為基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程,需要用到限制酶和DNA連接酶。(3)一個(gè)完整的基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因。(4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用的是農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用,將目的基因整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上,進(jìn)而使目的基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)可采用抗原—抗體雜交法。

47、7. 科學(xué)家從預(yù)期人的生長(zhǎng)激素的功能出發(fā),推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列,并人工合成了雙鏈DNA片段,獲得雙鏈DNA。 科學(xué)家將人的生長(zhǎng)激素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組,并使其成功地在大腸桿菌中表達(dá)。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—GGATCC—,限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—GATC—。據(jù)圖回答: (1)為了精確地獲取圖中的重組質(zhì)粒,應(yīng)用____________切割質(zhì)粒,用____________切割目的基因。 (2)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌B之前,要將大腸桿菌B放入一定濃度的____________溶液中處理,使之成為感受態(tài)的大腸桿菌。 (3)人的基因之所以能與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行

48、重組并發(fā)揮其功能,是因?yàn)槎叨际莀______________。人的生長(zhǎng)激素基因能在細(xì)菌體內(nèi)成功表達(dá)是因?yàn)開_____________。 (4)將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng),說明該菌已導(dǎo)入了__________________,反之則沒有導(dǎo)入。 (5)上述方法制備人的生長(zhǎng)激素,運(yùn)用的現(xiàn)代生物技術(shù)是____________。 答案 (1)限制酶Ⅰ 限制酶Ⅱ (2)CaCl2 (3)規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu) 二者共用一套(遺傳)密碼子 (4)普通質(zhì)?;蛑亟M質(zhì)?!?5)蛋白質(zhì)工程 解析 (1)根據(jù)圖示分析可知,目的基因插在了質(zhì)粒中含抗四環(huán)素基因的部位,而該位置有限制酶

49、Ⅰ和Ⅱ的識(shí)別位點(diǎn),但限制酶Ⅱ會(huì)同時(shí)在GeneⅠ和Ⅱ處切開,因此在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中,應(yīng)用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。目的基因的兩側(cè)均含有能被限制酶Ⅱ識(shí)別的堿基序列,所以用限制酶Ⅱ切割目的基因,能夠露出兩端的黏性末端。因此,為了精確地獲取圖中的重組質(zhì)粒,應(yīng)分別用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒和目的基因。(2)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌B之前,要將大腸桿菌B放入一定濃度的CaCl2溶液中處理,使之成為感受態(tài)的大腸桿菌。(3)人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行重組,是因?yàn)槿说幕蚺c大腸桿菌DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同。人的生長(zhǎng)激素基因能在細(xì)菌體內(nèi)成功表達(dá)是因?yàn)槿撕图?xì)菌共用一套(遺傳)密碼子。(4)將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng),說明該菌已導(dǎo)入了普通質(zhì)?;蛑亟M質(zhì)粒,因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒或重組質(zhì)粒中都含抗氨芐青霉素基因。(5)科學(xué)家從預(yù)期人的生長(zhǎng)激素的功能出發(fā),推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列,并人工合成了雙鏈DNA片段,獲得雙鏈DNA,從而合成人的生長(zhǎng)激素,這運(yùn)用了現(xiàn)代生物技術(shù)中的蛋白質(zhì)工程。

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