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1、致病菌細(xì)胞的近紅外光譜鑒別方法研究,導(dǎo) 師：劉建學(xué) 答辯人：榮宗有,立題意義,致病菌可導(dǎo)致人類(lèi)疾病或危害人類(lèi)健康，污染食品可引起食物中毒與食源性感染，是食品安全的重大隱患?？焖贆z測(cè)出食品中的致病菌是人們迫切的心愿。 本文以沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌為代表，利用對(duì)數(shù)期的沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌的近紅外光譜和主成分投影判別分析技術(shù)（PCA），鑒別沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌。 此項(xiàng)研究有可能對(duì)致病菌和有害微生物的鑒別測(cè)定提供一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。,試驗(yàn)方法, 采用平板劃線(xiàn)分離培養(yǎng)法和選擇性培養(yǎng)基 分離純種的沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌。 采用光電比濁法，對(duì)沙門(mén)氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行研究，確定沙門(mén)氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
2、根據(jù)不同濃度梯度的沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌的全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜圖譜，利用主成分投影判別分析技術(shù)，研究?jī)煞N菌的近紅外光譜鑒別方法。,結(jié)果分析,1、沙門(mén)氏菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 取出亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板看到呈褐色，灰色或黑色，帶有金屬光澤的菌落。并且菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基開(kāi)始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變?yōu)榱撕谏?，即是典型的沙門(mén)氏菌菌落。接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面上放在冰箱中保存，以備下一步試驗(yàn)用。,2、單增李斯特菌的分離培養(yǎng)結(jié)果 取出改良的MC Bride瓊脂（MMA）平板，斜光照射，可以看出菌落為灰藍(lán)或藍(lán)色、小的圓形菌落。挑取幾個(gè)發(fā)育良好的孤立菌落接種于三糖鐵（TSI）瓊脂和SIM動(dòng)力培養(yǎng)
3、基，培養(yǎng)于25的恒溫培養(yǎng)箱中，觀察到有動(dòng)力，且呈傘狀或月牙狀生長(zhǎng)的菌落。這是單增李斯特菌的典型菌落。接種到（TSAYE）試管斜面上放在冰箱中保存，以備下一步試驗(yàn)用。,3、 沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn),、比濁法測(cè)定的吸光度值 以未接種的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，按編號(hào)從小到大的順序依次進(jìn)行。沙門(mén)氏菌比濁測(cè)定的吸光度（OD）值見(jiàn)下表,、生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖,,、從生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖，可以看出0-5h為沙門(mén)氏菌的延緩期，5-16h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16h以后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。符合典型細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)四個(gè)時(shí)期的劃分。本實(shí)驗(yàn)選16h為沙門(mén)氏菌的培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。,4、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌的鑒
4、別,沙門(mén)氏菌不同濃度全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜疊加圖,,,,,單增李斯特菌不同濃度全細(xì)胞、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)的光譜疊加圖,,,, 沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的鑒別分析,,從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌全細(xì)胞的差異性信息。沙門(mén)氏菌第一組分得分范圍在-0.050.03之間，第二組分得分范圍在-0.13-0.02之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在-0.090.04之間，第二組分得分范圍在0.010.25之間。可見(jiàn)兩種菌的第一主分得分范圍幾乎完全相同，而第二主分得分范圍明顯不同。 不同的細(xì)菌，其細(xì)胞的物質(zhì)組成是不一樣的。不同的物質(zhì)在經(jīng)過(guò)近紅外光照射后會(huì)在不同的波段產(chǎn)
5、生紅外特異性吸收，且有著不同的吸收譜段，因此可以通過(guò)近紅外光譜法區(qū)分開(kāi)來(lái)。,沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的鑒別分析,,從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞壁的差異性信息。沙門(mén)氏菌第一組分得分范圍在-0.100.05之間，第二組分得分范圍在-0.020.15之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在0.050.28之間，第二組分得分范圍在-0.30-0.02之間?？梢?jiàn)兩種菌的第一主分和第二主分得分范圍完全不同。 沙門(mén)氏菌為革蘭氏陰性菌，單增李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性菌。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁除了肽聚糖還含有外膜，包括脂多糖、脂質(zhì)雙層、脂蛋白三部分；革蘭氏陽(yáng)性菌除了肽聚糖還含有
6、大量磷壁酸。其細(xì)胞壁組分不相同，不同的物質(zhì)在經(jīng)過(guò)近紅外光照射后會(huì)在不同的波段產(chǎn)生紅外特異性吸收，且有著不同的吸收譜段，因此可以通過(guò)近紅外光譜法區(qū)分開(kāi)來(lái)。,沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的鑒別分析,,從圖中可以看出，PCA分析可以良好的反映出沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌細(xì)胞質(zhì)的差異性信息。沙門(mén)氏菌第一組分得分范圍在0.040.12之間，第二組分得分范圍在-0.22-0.10之間；單增李斯特菌第一組分得分范圍在0.020.06之間，第二組分得分范圍在-0.030.12之間。兩種菌的第一主分得分范圍有相似的地方，第二主分得分范圍明顯不同。 細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)是指被細(xì)胞膜包圍的除核區(qū)以外的一切半透明、膠體狀、顆粒狀
7、物質(zhì)的總稱(chēng)，主要成分為核糖體、貯藏物、各種酶類(lèi)、中間代謝物、質(zhì)粒、各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和大分子的單體等。兩種不同的細(xì)菌其細(xì)胞質(zhì)組成也不同，所以可以通過(guò)近紅外光譜法區(qū)分開(kāi)來(lái) 。,總結(jié),1、采用平板劃線(xiàn)分離培養(yǎng)法和選擇性培養(yǎng)基可將沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌從雜菌中很好的分離開(kāi)來(lái)。 2、采用比濁法對(duì)沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行研究，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。研究表明：5-16h為沙門(mén)氏菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。所以可選取培養(yǎng)16h的沙門(mén)氏菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。,3、根據(jù)不同濃度梯度的沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌的全細(xì)胞、細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的近紅外光譜，利用基于主成分分析技術(shù)的投影判別分析，可以將沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。 4、近紅外光譜分析技術(shù)可以用于沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌的分類(lèi)鑒別。為建立一種快速的致病菌檢測(cè)方法提供依據(jù)。,5、但是，到底是什么物質(zhì)引起近紅外光產(chǎn)生特異性吸收還不知道，尚需進(jìn)一步研究，利用近紅外光譜分析技術(shù)對(duì)更多種類(lèi)致病菌的檢測(cè)技術(shù)也需要進(jìn)一步研究。,講解完畢！,O(_)O 謝謝?。?！,
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