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1、第34講克隆技術,突破1 植物細胞工程,突破2 動物細胞工程,總綱目錄,一、細胞工程 1.應用的原理和方法:細胞生物學和分子生物學的原理和方法。,2.操作水平:細胞水平或細胞器水平。,3.目的:按照人的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得細胞產品。 4.分類:根據操作對象的不同,分為植物細胞工程和動物細胞工程。,1.原理:細胞的全能性。 (1)原因:生物的任何一個細胞都包含本物種的全部遺傳信息。 (2)全能性表達的條件:處于離體狀態(tài),提供一定的營養(yǎng)、激素 和其他適宜的外界條件。,二、植物細胞工程,2.植物組織培養(yǎng)技術 離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織 根、芽植物體,3.植物體細胞雜交技術 (1)
2、去壁:酶解法,所用酶為纖維素酶和果膠酶。 (2)誘導原生質體融合:物理法離心、振動、電激等;化學法常用聚乙二醇(PEG)做誘導劑。 (3)植物體細胞雜交成功的標志:雜種細胞再生出細胞壁。 (4)優(yōu)點:克服遠緣雜交不親和的障礙。 (5)變異類型:染色體變異。,4.植物細胞工程的實際應用 (1)植物繁 殖新途徑 (2)作物新品種的培育:單倍體育種、突變體的利用。 (3)細胞產物的工廠化生產:利用植物組織培養(yǎng)技術生產蛋白 質、脂肪、糖類、藥物、香料和生物堿等物質。,1.動物細胞培養(yǎng) (1)過程 (2)條件 a.無菌、無毒的環(huán)境無菌處理、加抗生素殺菌、定期更換培養(yǎng)液。,三、動物細胞工程,b.營養(yǎng)糖、氨
3、基酸、促生長因子、無機鹽和微量元素+血清 或血漿等天然成分。 c.適宜的溫度(36.50.5 )和pH(7.27.4)。,d.氣體環(huán)境95%空氣+5%CO2(維持培養(yǎng)液的pH)。 (3)應用:生產細胞產品,如干擾素、疫苗、單克隆抗體;檢測并判斷某物質毒性的大小;臨床醫(yī)學研究。,2.動物體細胞核移植 (1)原理:動物細胞核具有全能性。 (2)過程,3.動物細胞融合與單克隆抗體制備 (1)誘導動物細胞融合的方法:物理法離心、振動、電激等;化學法聚乙二醇;生物法滅活的病毒。 (2)單克隆抗體制備過程,(3)單克隆抗體的優(yōu)點:特異性強、靈敏度高、可大量制備。 (4)單克隆抗體的應用:作為診斷試劑;用于
4、治療疾病和運載藥物。 四、生物技術中的倫理問題,1.克隆人 (1)分類 a.生殖性克隆是指以繁殖個體為目的的克隆,即用于產生人類個體。 b.治療性克隆是指利用核移植技術獲得克隆人胚胎,然后從胚胎 中提取干細胞進行醫(yī)學研究,是利用克隆技術產生特定細胞和 組織(皮膚、神經或肌肉等)用于治療性移植的克隆。 (2)中國態(tài)度:禁止生殖性克隆人,不反對治療性克隆。,2.試管嬰兒與設計試管嬰兒 (1)試管嬰兒:運用體外受精和胚胎移植技術繁殖個體,目的是解決 不孕夫婦的生育問題。 (2)設計試管嬰兒:體外受精獲得的胚胎在移植前進行遺傳學診斷, 以便篩選出符合特定要求的胚胎。,1.乳腺細胞比乳腺癌細胞更容易進行
5、離體培養(yǎng)。( ),2.在愈傷組織培養(yǎng)中加入細胞融合的誘導劑,可獲得染色體加倍的細胞。( ),3.棉花根尖細胞經誘導形成幼苗能體現細胞的全能性。( ),4.二倍體植株的花粉經脫分化與再分化后能得到穩(wěn)定遺傳的植株。 ( ),5.植物的每個細胞在植物體內和體外都能表現出細胞的全能性。 ( ),6.用人工薄膜將胚狀體、愈傷組織等分別包裝可制成人工種子。( ),,,,,,,8.未經克隆化培養(yǎng)的細胞系細胞具有相同的性狀。( ),7.由多個祖細胞培養(yǎng)形成的細胞群為一個克隆。( ),9.由動物組織細胞培養(yǎng)到連續(xù)細胞系的過程,得到的細胞大多具有二倍體核型。( ),10.培養(yǎng)哺乳動物胚胎的培養(yǎng)
6、液,其成分較簡單,一般只需一些無機鹽和有機鹽類即可。( ),11.動物細胞培養(yǎng)技術可用于轉基因動物的培育。( ),,,,,,1.細胞全能性 (1)原理:細胞含有本物種全部的遺傳信息。 (2)體內細胞全能性不表達的原因:基因在特定的時間和空間條件下選擇性表達。 (3)細胞全能性表達的條件:具完整細胞核;離體;無菌;一定的營養(yǎng)、激素和適宜的外界條件。,突破1植物細胞工程,(4)一般地,細胞全能性大小與細胞分化程度成反比。 (5)全能性大小: 植物細胞:受精卵生殖細胞體細胞。 動物細胞:受精卵生殖細胞體細胞核。 (動物細胞全能性受限制,但細胞核具有全能性),2.植物組織培養(yǎng)與體細胞雜交,知能拓展
7、影響植物組織培養(yǎng)的幾種主要因素 (1)植物激素:影響脫分化、再分化的重要因素為植物激素。當細胞分裂素與生長素共同使用時,能強烈地促進愈傷組織的形成,兩者不同濃度的配比在再分化過程中,分別對誘導根或芽的產生起關鍵作用。當細胞分裂素與生長素的濃度比高時,有利于芽的產生;濃度比低時,有利于根的產生。 (2)光照:對于植物組織培養(yǎng),光照條件非常重要,包括光照強度、時間和波長。但在愈傷組織的誘導階段往往要暗培養(yǎng),而在愈傷組織分化出芽和葉的過程中一定要有光照。愈傷組織誘導階段的暗培養(yǎng)有利于細胞的脫分化產生愈傷組織,如果在光照條件下則容易分化產生維管等組織,不利于產生大量的愈傷組織。,(3)無菌:培養(yǎng)基上的
8、細菌等微生物比植物細胞具有更強的新陳代謝能力,比植物細胞生長繁殖得更快,而且它們往往會產生毒素,使培養(yǎng)基上的植物細胞死亡。因此,在培養(yǎng)過程中要求一系列的消毒、滅菌處理,并且要求無菌操作。,3.單倍體育種和突變體利用的比較,1.(2018北京西城期末)通過植物組織培養(yǎng)可獲得完整幼苗。下列對此過程的敘述,正確的是() A.花粉不含完整的基因組,不能培養(yǎng)成單倍體植株 B.選擇植物幼嫩的部分作外植體,更易誘導脫分化 C.植物組織培養(yǎng)過程中可發(fā)生基因突變和基因重組 D.植物組織培養(yǎng)過程不需添加有機碳源但需要光照,考向1以基礎判斷或實例分析的形式,考查植物的組織培養(yǎng),B,答案B花粉含有該植物的全套遺傳信息
9、,可以經花藥離體培養(yǎng)而培養(yǎng)成單倍體植株,A錯誤;幼嫩部位的新陳代謝旺盛,分化程度低,更易誘導脫分化過程發(fā)生,B正確;植物組織培養(yǎng)是無性生殖過程,不產生配子,故在有絲分裂間期可發(fā)生基因突變,但無法發(fā)生基因重組,C錯誤;植物組織培養(yǎng)過程中需要有機碳源,脫分化過程要嚴格避光,D錯誤。,2.(2017北京師大附中期中)下列有關植物組織培養(yǎng)的敘述,正確的是 () A.愈傷組織是一團有特定結構和功能的薄壁細胞 B.二倍體植株的花粉經脫分化與再分化后得到穩(wěn)定遺傳的植株 C.用人工薄膜將胚狀體、愈傷組織等分別包裝可制成人工種子 D.植物耐鹽突變體可通過添加適量NaCl的培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選而獲得,D,答案D愈傷組織
10、是一團排列疏松而無規(guī)則、高度液泡化的、呈無定形狀態(tài)的、具有分生能力的薄壁細胞,不具有特定的結構和功能,A錯誤;二倍體植株的花粉中只含一個染色體組,培養(yǎng)得到的個體為單倍體,高度不育,B錯誤;人工種子中包裹的是再分化形成的胚狀體或不定芽、頂芽和腋芽等,但不能是愈傷組織,C錯誤;用特定的選擇培養(yǎng)基可篩選出所需的突變體類型,如可利用加適量NaCl的培養(yǎng)基對植物耐鹽突變體進行篩選,D正確。,考向2以實例分析的形式,考查植物體細胞雜交 3.“白菜甘藍”是用細胞工程的方法培育出來的蔬菜新品種,它具有生長期短、耐熱性強和易于儲藏等優(yōu)點。如圖是“白菜甘藍”的雜交過程示意圖。以下說法正確的是(),A.除去細胞壁形
11、成原生質體,可運用的酶是纖維素酶、淀粉酶和果膠酶 B.通常可誘導上述原生質體相互融合的方法是PEG和滅活的病毒誘導 C.雜種細胞形成的標志是產生了新的細胞壁 D.愈傷組織形成“白菜甘藍”植物體必須經過脫分化和再分化兩個 過程,答案C用于除去植物細胞壁的酶有纖維素酶和果膠酶;植物體細胞雜交過程中誘導原生質體融合不能用滅活的病毒;雜種細胞形成的標志是產生了新的細胞壁;愈傷組織形成“白菜甘藍”植物體屬于再分化過程。,4.下面為“番茄馬鈴薯”的培育過程示意圖,請據圖回答下列問題: (1)若運用傳統有性雜交(即用番茄、馬鈴薯雜交)能否得到可育的雜種植株?為什么?。,(2)在利用雜種細胞培育雜種植株的過程
12、中,運用的技術手段是 ,依據的原理是,其中過程稱為技術,與過程密切相關的具有單層膜結構的細胞器為,過程相當于,過程涉及的細胞分裂方式為。 (3)已知番茄、馬鈴薯分別為四倍體、二倍體,則“番茄馬鈴薯”屬于倍體植株。 (4)柴油樹種子含有的柴油是植物細胞的代謝產物,可用植物組織培養(yǎng)來實現柴油的工業(yè)化生產。若利用此技術,將柴油樹細胞培養(yǎng)進行到(填字母編號)階段即可。,答案(1)不能。不同種的植物存在生殖隔離 (2)植物組織培養(yǎng)植物細胞的全能性原生質體融合高爾基體脫分化有絲分裂 (3)六 (4)e 解析(1)番茄和馬鈴薯屬于兩種植物,存在生殖隔離,不能通過有性雜交產生后代。(2)過程是把a、b兩個原
13、生質體融合在一起,所以稱為原生質體融合。過程是在融合的原生質體外再生一層細胞壁,而植物細胞壁的形成與高爾基體有關。過程的結果是形成了愈傷組織,所以為脫分化。(3)“番茄馬鈴薯”屬于異源多倍體中的異源六倍體。(4)柴油是植物細胞的代謝產物,要實現其工業(yè)化生產需將柴油樹細胞 培養(yǎng)到愈傷組織階段,然后進行提取。,突破2動物細胞工程,1.動物細胞培養(yǎng)與動物體細胞核移植,2.細胞融合的過程分析 細胞融合的過程包括細胞膜融合、細胞質融合和細胞核融合,其中細胞膜融合是細胞融合的先導,在細胞膜融合中體現出細胞膜具有一定的流動性。,3.單克隆抗體的制備 (1)血清抗體與單克隆抗體,(2)制備單克隆抗體過程中的
14、兩次篩選,(3)獲取單克隆抗體的場所 若在培養(yǎng)基中進行雜交瘤細胞培養(yǎng),則從培養(yǎng)液中提取。 若在小鼠或其他動物腹腔中培養(yǎng),則從腹水中提取。,1.下列關于動物細胞培養(yǎng)、植物組織培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的敘述,正確的是() A.培養(yǎng)基都需要加入瓊脂 B.所用的培養(yǎng)溫度都相同 C.都要經歷脫分化和再分化過程 D.都需要無菌培養(yǎng)條件,考向1以基礎判斷或實例分析的形式,考查動物細胞培養(yǎng)的特點及應用,D,答案D動物細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基,不用添加瓊脂,A錯誤;動物細胞培養(yǎng)、植物組織培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)所需培養(yǎng)溫度不一定相同,B錯誤;只有植物組織培養(yǎng)才要經歷脫分化和再分化過程,C錯誤;動物細胞培養(yǎng)、植物組織培養(yǎng)和
15、微生物培養(yǎng)都需要無菌培養(yǎng)條件,D正確。,2.(2016課標全國)下圖表示通過核移植等技術獲得某種克隆哺乳動物(二倍體)的流程。 回答下列問題: (1)圖中A表示正常細胞核,染色體數為2n,則其性染色體的組成可為。過程表示去除細胞核,該過程一般要在卵母細胞培養(yǎng)至適當時期再進行,去核時常采用的方法。代表的過程是。,(2)經過多次傳代后,供體細胞中的穩(wěn)定性會降低。因此,選材時必須關注傳代次數。 (3)若獲得的克隆動物與供體動物性狀不完全相同,從遺傳物質的角度分析其原因是。 (4)與克隆羊“多莉(利)”培育成功一樣,其他克隆動物的成功獲得也證明了。,答案(1)XX或XY顯微操作胚胎移植 (2)遺傳物質
16、 (3)卵母細胞的細胞質中的遺傳物質會對克隆動物的性狀產生影響 (4)動物已分化體細胞的細胞核具有全能性 解析(1)因供體的性別不確定,故其細胞核內的性染色體組成為XX或XY;一般將卵母細胞培養(yǎng)到M中期,用顯微操作法將其細胞核去除;代表的過程是胚胎移植。(2)傳代培養(yǎng)10代以內的細胞可以保持正常的二倍體核型,超過10代以后,供體細胞中遺傳物質的穩(wěn)定性會降低。(3)克隆動物細胞質中的遺傳物質來自卵母細胞的細胞質,細胞質中的遺傳物質對克隆動物的性狀會產生影響。(4)克隆動物的成功獲得可以證明動物已分化的體細胞的細胞核具有全能性。,3.將特定藥物與單克隆抗體相結合制成的“生物導彈”,能夠用于殺死人類
17、某些癌細胞。其過程如圖所示。下列相關敘述不正確的是() 抗癌藥物,考向2以實例分析的形式,考查動物細胞融合與單克隆抗體的制備,A.過程的原理和植物原生質體融合的原理基本相同 B.經形成的雜交瘤細胞能無限增殖并產生單一抗體 C.過程需要篩選并克隆單個雜交瘤細胞 D.抗體的靶向作用使過程具有高度特異性,答案B細胞融合后,需經過篩選才能獲得既能無限增殖,又能產生單一抗體的雜交瘤細胞。,4.(2018北京東城期末)中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)能夠高效表達外源基因?？茖W研究中常使用重組CHO細胞(導入了重組載體的CHO細胞)大量生產外源蛋白,一般步驟為:.長期傳代培養(yǎng),獲得大量重組細胞;.批式培養(yǎng),獲
18、得大量外源蛋白。 (1)體外培養(yǎng)動物細胞的基本培養(yǎng)液(BM)中除抗生素和一般營養(yǎng)物質外,還應含有。為了獲得能生產抗體A的重組CHO細胞,需要將含有抗體A基因的重組載體通過法導入CHO細胞,經篩選獲得重組CHO細胞。 (2)研究發(fā)現,酵母抽提物(YE)在動物細胞培養(yǎng)和促進蛋白質表達中具有重要作用。為確定YE在不同培養(yǎng)階段的使用策略,研究人員進行了下列實驗。,圖1所示實驗探究了在長期傳代培養(yǎng)階段對重組CHO細胞增殖以及抗體A表達量的影響。通過細胞計數和計算得出實驗結果如圖2所示,結果說明。此處理對后續(xù)批式培養(yǎng)中的細胞增殖及單個細胞的抗體產量基本無影響。,圖1,圖2 進一步探究YE對批式培養(yǎng)階段的影
19、響,應在階段、分別使用和進行培養(yǎng)。結果表明,抗體A的總產 量隨著YE濃度的提高而增加。 綜上所述,為提高抗體A的總產量,整個培養(yǎng)過程中對YE的使用策略是。,答案(1)動物血清顯微注射 (2)不同濃度的YE較低濃度YE促進細胞增殖,較高濃度YE抑制細胞增殖 BM添加不同濃度YE的BM 傳代培養(yǎng)過程中添加低濃度YE,批式培養(yǎng)過程中添加高濃度YE 解析(1)體外培養(yǎng)動物細胞,培養(yǎng)基中除了添加抗生素和一般營養(yǎng)物質外,還應含有動物血清。因為要將重組載體導入動物細胞(倉鼠卵巢細胞),所以應采用顯微注射法。(2)圖1實驗中后四組分別加入了1、2、5、10 g/L 的YE,因此是探究了長期傳代培養(yǎng)階段不同濃度YE對重組CHO細胞增殖以及抗體A表達量的影響。從圖2中可看出YE濃度為0 g/L時細胞數相對值(對照組)接近0.8,而YE濃度為1 g/L時細胞數相對值,高于對照組,YE濃度為2、5、10 g/L時,細胞數相對值低于對照組,因此可得出結論:較低濃度YE促進細胞增殖,較高濃度YE抑制細胞增殖。為了研究YE對批式培養(yǎng)階段的影響,應在階段加入BM,階段加入含不同濃度YE的BM。在整個培養(yǎng)過程中,長期傳代培養(yǎng)應加入低濃度的YE,而批式培養(yǎng)應加入高濃度的YE,保證各時期均能產生較多抗體。,
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