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1、實(shí)驗(yàn)二 電子顯微鏡的原理及使用,光學(xué)顯微鏡的發(fā)明為人類認(rèn)識(shí)微觀世界提供了重要的工具。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，光學(xué)顯微鏡因其有限的分辨本領(lǐng)而難以滿足許多微觀分析的需求。上世紀(jì)30年代后，電子顯微鏡的發(fā)明將分辨本領(lǐng)提高到納米量級(jí)，同時(shí)也將顯微鏡的功能由單一的形貌觀察擴(kuò)展到集形貌觀察、晶體結(jié)構(gòu)、成分分析等于一體。人類認(rèn)識(shí)微觀世界的能力從此有了長(zhǎng)足的發(fā)展。,電鏡技術(shù)（又稱電子顯微術(shù)）是一門技術(shù)性很強(qiáng)的綜合性學(xué)科。就電鏡技術(shù)而言，屬現(xiàn)代物理學(xué)范疇；就組織和細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（含超微病理）而言，屬現(xiàn)代分子細(xì)胞生物學(xué)及形態(tài)學(xué)范疇。,電子顯微鏡技術(shù)（electron microscopy）是研究細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的有力手
2、段，因此該技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)的重要研究方法之一。 電子顯微鏡（electron microscope，EM）是以電子波作為光源，電磁場(chǎng)作透鏡，利用電子散射過程產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行顯微成像的大型儀器設(shè)備。,電子顯微鏡的發(fā)展史,Max Knoll(1897-1969) Ernst Ruska(1906-1988),電子顯微鏡的分辨率可以達(dá)到納米級(jí)(10-9m)?？捎脕碛^察很多在可見光下看不見的物體,例如病毒。 Ruska獲1986年度的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。,1938年，德國工程師Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一臺(tái)透射電子顯微鏡(TEM)。,電子顯微鏡下的蚊子,Charles Oat
3、ley,1952年，英國工程師Charles Oatley制造出了第一臺(tái)掃描電子顯微鏡(SEM)。,一、電子顯微鏡 近年來，電鏡的研究和制造有了很大的發(fā)展。一方面，電鏡的分辨率不斷提高，透射電鏡的點(diǎn)分辨率達(dá)到了0.2-0.3nm，晶格分辨率已經(jīng)達(dá)到0.1nm左右，通過電鏡，人們已經(jīng)能直接觀察到原子像；另一方面，除透射電鏡外，還發(fā)展了多種電鏡，如掃描電鏡、分析電鏡等。,,,1透射電鏡（TEM） 透射電鏡即透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，簡(jiǎn)稱TEM），通常稱作電子顯微鏡或電鏡（EM），是使用最為廣泛的一類電鏡。,,,,工作原理：在細(xì)胞生物學(xué)上，可
4、用于觀察和研究細(xì)胞內(nèi)部的亞顯微鏡結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的形態(tài)結(jié)構(gòu)及病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡以電子槍作為照明光源，從電子槍燈絲發(fā)射的電子束經(jīng)聚光鏡會(huì)聚照射到樣品上。帶有樣品結(jié)構(gòu)信息的透射電子（transmission electrons，TE）進(jìn)入成像系統(tǒng)，被各級(jí)成像透鏡聚焦、放大后，投射在觀察熒光屏上，形成透射電子顯微鏡像。 主要優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，可用來觀察組織和細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)以及微生物和生物大分子的全貌。,透射電鏡的結(jié)構(gòu)： 主要由照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、觀察與記錄系統(tǒng)、電源及電器系統(tǒng)等六部分組成,根據(jù)加速電壓的大小分為以下3種： （1）一般TEM。最常用的是1
5、00KV電鏡。這種電鏡分辨率高（點(diǎn)0.3nm，晶格0.14nm），但穿透本領(lǐng)小，觀察樣品必須很薄，約為30100nm，如細(xì)胞和組織的超薄切片、復(fù)型膜和負(fù)染樣品等。相當(dāng)普及。我校有這樣的設(shè)備。 （2）高壓TEM。目前常用的是200KV電鏡。這種電鏡對(duì)樣品的穿透本領(lǐng)約為100KV電鏡的1.6倍，可以在觀察較厚樣品時(shí)獲得很好的分辨本領(lǐng)，從而可以對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維觀察。 （3）超高壓TEM。目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高壓TEM。這類電鏡具有穿透本領(lǐng)強(qiáng)、輻射損傷小、可以配備環(huán)境樣品室及進(jìn)行各種動(dòng)態(tài)觀察等優(yōu)點(diǎn)，分辨率也已達(dá)到或超過100KV電鏡的水平。在超高壓電鏡上附加充氣樣品室，
6、使人們可以觀察活細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化。,透射電鏡下根尖細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖,透射電鏡下細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸亞顯微結(jié)構(gòu),,,,,2掃描電鏡（SEM） 掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，簡(jiǎn)稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。,掃描電鏡原理,,,工作原理：利用電子射線轟擊樣品表面，引起二次電子等信號(hào)的發(fā)射，經(jīng)檢測(cè)裝置接收后成像的一類電鏡。 主要優(yōu)點(diǎn)：景深長(zhǎng)，所獲得的圖像立體感強(qiáng)，可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。,一些電鏡圖片,染色體 染色體 被精子包圍的卵子,骨髓細(xì)胞
7、SARS AIDS,人類紅細(xì)胞,酵母,人類精子,依據(jù)性能不同主要分為： （1）一般SEM。目前一般掃描電鏡采用熱發(fā)射電子槍，分辨率為6nm左右，若采用六硼化鑭電子槍，分辨率可提高到45nm。 （2）場(chǎng)發(fā)射電子槍SEM。由于場(chǎng)發(fā)射電子槍具有亮度高、能量分散少，陰極源尺寸小等優(yōu)點(diǎn)，這種電鏡的分辨率已達(dá)到3nm。場(chǎng)發(fā)射電子槍SEM的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以在低加速電壓下進(jìn)行高分辨率觀察，因此可以直接觀察絕緣體而不發(fā)生充、放電現(xiàn)象。 （3）生物用SEM。這種SEM備有冰凍冷熱樣品臺(tái)，可把含水生物樣品迅速冷凍并對(duì)冰凍樣品進(jìn)行觀察，可以減少化學(xué)處理引起的人為變化，使觀察樣品更接近于自然狀態(tài)。如要
8、觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還可用冷刀把樣品進(jìn)行切開，加溫使冰升華，并在其上噴鍍一層金屬再進(jìn)行觀察，所有這些過程都在SEM中不破壞真空的狀態(tài)下進(jìn)行。,3電子探針 電子探針主要用于探測(cè)微小區(qū)域的元素成分。其原義僅是一個(gè)物理學(xué)名詞，意指聚焦了的電子束。當(dāng)電子束照射樣品表面時(shí)，可激發(fā)X射線，X射線光量子的能量及波長(zhǎng)與元素的原子序數(shù)有關(guān)，稱為特征X射線。采用晶體分光光譜法測(cè)定X射線的波長(zhǎng)和強(qiáng)度來分析樣品成分的儀器，稱為X射線分光光譜儀或電子探針；用鋰漂移硅探頭測(cè)定X射線能量和強(qiáng)度的儀器稱為X射線能譜儀。,掃描隧道顯微鏡及原理,掃描隧道顯微鏡圖片,硅表面 納米算盤,由單個(gè)原子構(gòu)成 的“IBM”,4分析電
9、鏡 分析電鏡是利用電子射線轟擊樣品所產(chǎn)生的X射線或俄歇電子對(duì)樣品元素進(jìn)行分析的一類電鏡。其特點(diǎn)是能在觀察超微結(jié)構(gòu)的同時(shí)，對(duì)樣品中一個(gè)極微小的區(qū)域進(jìn)行化學(xué)分析，從而在超微結(jié)構(gòu)水平上測(cè)定各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分及其變化規(guī)律。 （1）分析TEM。在TEM上配備X射線能譜儀后即成為分析TEM，目前很多100KV和200KV TEM都可以裝上X射線檢測(cè)附件，進(jìn)行樣品的元素分析。 （2）分析SEM。在SEM上配備X射線能譜儀后，便可兼有電子探針分析樣品化學(xué)成分的功能。 （3）掃描俄歇電鏡。把SEM與俄歇電子能量分析儀相結(jié)合，即成為掃描俄歇電鏡，它能對(duì)樣品表面進(jìn)行微區(qū)元素分析，是一種表面微觀分析電鏡。,5掃描
10、透射電鏡 SEM中電子射線作用于樣品后，其中一部分電子可透過樣品成為透射電子，將透過樣品的透射電子和散射電子用檢測(cè)器接收成像，即成為掃描透射電鏡。這種電鏡一般用場(chǎng)發(fā)射電子槍，兼有TEM、SEM和分析電鏡的特點(diǎn)，能觀察較厚的樣品，分辨本領(lǐng)和成像質(zhì)量都很好，是近年來電鏡技術(shù)的最大改進(jìn)之一。,二、電子顯微術(shù) 電鏡具有很高的分辨本領(lǐng)，能觀察極微小的結(jié)構(gòu)。但是電鏡不能直接觀察天然狀態(tài)下的生物標(biāo)本，必須通過各種技術(shù)將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡生物樣品，才能放入電鏡進(jìn)行觀察，這些電鏡樣品制備技術(shù)稱為電子顯微術(shù)。 電子顯微術(shù)：將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡觀察用生物樣品的制備技術(shù)。,,1與TEM有關(guān)的電子顯微術(shù) （1）
11、超薄切片技術(shù)。 超薄切片技術(shù)就是通過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，將生物標(biāo)本切成薄于0.1m的超薄切片的樣品制備技術(shù)，用于生物組織的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)研究。,,,玻璃刀制作儀,超薄切片機(jī)局部,（2）負(fù)染色技術(shù)。 利用電子密度比標(biāo)本高的重金屬鹽（如磷鎢酸鈉、醋酸鈾等）將生物標(biāo)本包圍起來，增強(qiáng)背景散射電子的能力以提高反差，在黑暗的背景下顯示標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu)，稱負(fù)染色技術(shù)。這一技術(shù)操作簡(jiǎn)便，主要用于顆粒狀標(biāo)本（如細(xì)菌、病毒、分離細(xì)胞器等）的研究。 （3）冷凍蝕刻技術(shù)。 在快速冷凍下對(duì)生物樣品進(jìn)行斷裂、蝕刻和復(fù)型，制備生物樣品復(fù)型膜的技術(shù)稱冷凍蝕刻技術(shù)。在電鏡下觀察復(fù)型膜可獲得立體感強(qiáng)的超微結(jié)構(gòu)圖像，
12、主要用于生物膜結(jié)構(gòu)的研究。,,（4）電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 在超微結(jié)構(gòu)水平上，通過電鏡細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來研究細(xì)胞成分的分布和變化的方法稱電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。這一技術(shù)把細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與其化學(xué)組成有機(jī)地結(jié)合起來，目前主要用于研究細(xì)胞內(nèi)各種大分子物質(zhì)和酶的定位等。 （5）免疫電鏡技術(shù)。 這是一種使抗原在超微結(jié)構(gòu)水平上定位的技術(shù)，應(yīng)用與抗原相應(yīng)的標(biāo)記抗體，在電鏡下觀察標(biāo)記物的位置，從而定位相應(yīng)抗原。這一技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。 （6）電鏡放射自顯影技術(shù)。 這是電鏡技術(shù)與放射自顯影技術(shù)相結(jié)合，觀察放射性物質(zhì)在超微結(jié)構(gòu)水平上的定位和變化，從而了解細(xì)胞的各種代謝活動(dòng)。這一技術(shù)使結(jié)構(gòu)與功能的研究結(jié)合起來，是一種
13、動(dòng)態(tài)的研究方法。,,,,2與SEM有關(guān)的電子顯微術(shù) （1）SEM常規(guī)制樣技術(shù)。SEM適合于研究生物樣品的表面特征，樣品制備包括樣品觀察面的暴露、固定、干燥和導(dǎo)電等步驟，使表面特征充分暴露而不變形。這一技術(shù)是 SEM樣品制備的常規(guī)技術(shù)，主要用于組織、細(xì)胞、寄生蟲等表面形貌的研究。下圖為SEM標(biāo)本處理設(shè)備。,臨界點(diǎn)干燥器 離子濺射儀,,,（2）生物標(biāo)本割裂技術(shù)。 將生物標(biāo)本放在特殊包埋劑中經(jīng)冷凍或其他方法固化，然后把固化的標(biāo)本割裂，暴露組織和細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，再經(jīng)干燥和導(dǎo)電后在 SEM下觀察。這一技術(shù)使 SEM能觀察生物標(biāo)本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，目前最常用的是冷凍割裂技術(shù)。 （3）鑄型技術(shù)。 用鑄型技術(shù)（如甲基丙烯酸酯）注入生物體的腔性器官，制成鑄型標(biāo)本，可在SEM下觀察管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)。目前最常用的是血管鑄型技術(shù)，用以研究微小血管的分布和形貌。,作 業(yè) 1.結(jié)合理論教學(xué)并查閱資料簡(jiǎn)述掃描電鏡與透射電鏡在原理、結(jié)構(gòu)和應(yīng)用方面的主要區(qū)別。 2.結(jié)合錄像，簡(jiǎn)述超薄切片制備技術(shù)的主要過程。,
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