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1、課后限時集訓40 基因工程
1．科學工作者將某種海蜇的DNA分子上一段長度為5 170個堿基對的片段——綠色熒光蛋白基因，轉入到夾竹桃細胞中，培育出一種夜間發(fā)光的夾竹桃。培育過程如圖所示，回答有關問題。
(1)構建圖中的重組Ti質粒，還需用到的基因工程基本工具是____________________。作為受體農(nóng)桿菌應________________，以方便篩選已導入重組Ti質粒的受體農(nóng)桿菌。在將重組Ti質粒轉入農(nóng)桿菌之前，先要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，其目的是使其成為__________________細胞。
(2)圖中將綠色熒光蛋白基因導入夾竹桃細胞的方法稱為__________
2、____。轉基因夾竹桃幼苗對青霉素__________(填“具有”或“不具有”)抗性，原因是______________________________________。
(3)綠色熒光蛋白基因含有____________，因此在農(nóng)桿菌細胞中不能正常表達，而在夾竹桃細胞中能正常表達。
[解析] (1)構建圖中的重組Ti質粒，還需用到的基因工程基本工具是限制性核酸內(nèi)切酶(或限制酶)、DNA連接酶。由于Ti質粒上含有抗青霉素基因，故作為受體農(nóng)桿菌應不含抗青霉素基因(或對青霉素敏感)，以便根據(jù)質粒上的標記基因篩選導入重組質粒的農(nóng)桿菌。在將重組Ti質粒轉入農(nóng)桿菌之前，先要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，其目
3、的是使其成為感受態(tài)細胞，易于吸收周圍環(huán)境中的外源DNA分子。
(2)圖示中將綠色熒光蛋白基因導入夾竹桃細胞的方法稱為農(nóng)桿菌轉化法。根據(jù)圖示可知目的基因插入在了質粒上的T-DNA片段，由于T-DNA可轉移至受體細胞并且整合到受體細胞的染色體DNA上，所以插入在T-DNA中的目的基因被導入夾竹桃細胞并整合到了染色體DNA上，而抗青霉素基因沒有進入夾竹桃細胞，故轉基因夾竹桃幼苗對青霉素不具有抗性。
(3)綠色熒光蛋白基因來自真核生物，含有內(nèi)含子，轉錄后需要將內(nèi)含子轉錄的部分在細胞核進行剪切，而農(nóng)桿菌為原核生物，不具備該剪切功能，因此在農(nóng)桿菌細胞中不能正常表達，而在夾竹桃細胞中能正常表達。
[答
4、案] (1)限制性核酸內(nèi)切酶(或限制酶)、DNA連接酶 不含有抗青霉素基因(或對青霉素敏感) 感受態(tài) (2)農(nóng)桿菌轉化法 不具有 農(nóng)桿菌(或重組Ti質粒)中只有T-DNA才能進入夾竹桃細胞，而抗青霉素基因沒有進入夾竹桃細胞 (3)內(nèi)含子
2．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內(nèi)，可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}：
(1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是__________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是________
5、_________。
(2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_______________________。
(3)若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是__________________________________(答出兩點即可)。
(4)當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是____________________________________________________。
(5)若獲得的轉基因植株(幾丁質酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的
6、原因是______________。
(6)目前關于轉基因生物安全性的爭論主要集中在________安全、________安全和________安全三個方面，而這三個方面的爭論發(fā)生的原因主要還是因為轉基因生物的特性及其對現(xiàn)存生物和自然環(huán)境的影響具有很大的不確定性。例如，由于________________________________________，因此在轉基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果。
[解析] (1)與老葉相比，嫩葉組織細胞易破碎，容易提取到幾丁質酶的mRNA。提取RNA時，提取液中添加RNA酶抑制劑可防止RNA被RNA酶催化降解。
(2)以mRNA為模板，按照
7、堿基互補配對原則，在逆轉錄酶的作用下，通過逆轉錄(反轉錄)可以獲得cDNA。
(3)因該目的基因是通過逆轉錄形成的，無表達所需的啟動子，也無在受體細胞內(nèi)進行復制所需的復制原點等，所以在受體細胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在和表達，也不能遺傳下去。
(4)構建基因表達載體時，DNA連接酶能催化目的基因和質粒載體這兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。
(5)轉基因植株的基因組中含有幾丁質酶基因，但該植株抗真菌的能力并沒有提高，可能是由于轉錄或翻譯異常，即幾丁質酶基因未能正常表達。
(6)目前關于轉基因生物安全性的爭論主要集中在食物安全、生物安全和環(huán)境安全三個方面。由于外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的
8、，加之轉移的基因不少都是異種生物的基因，因此在轉基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果。
[答案] (1)嫩葉組織細胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA (3)目的基因無復制原點；目的基因無表達所需啟動子 (4)磷酸二酯鍵 (5)目的基因的轉錄或翻譯異?！?6)食物 生物 環(huán)境 外源基因插入宿主基因組的部位往往是隨機的(轉移的基因不少都是異種生物的基因)
3．(2019·安徽省宣城市高三期末)煙草是有重要經(jīng)濟價值的雙子葉植物，易受TMV(煙草花葉病毒)感染而大幅度減產(chǎn)。絞股藍細胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMⅤ感
9、染。研究人員利用轉基因技術培育出了抗TMⅤ煙草，操作流程如圖所示。
(1)①表示遺傳信息流動中的________過程，所需原料為________。過程③所需要的工具酶是________________________________________。
(2)大量擴增目的基因可以使用PCR技術，該技術包括變性、退火、延伸三個步驟，變性這一步驟的目的是____________________________。
(3)過程④最常用的方法是________，過程⑤用到的細胞工程技術是______________________________。
(4)過程⑥還需要進行基因工程操作步驟中的_
10、_______________，其中，在個體水平上檢驗獲得的煙草能否抗TMV的方法是_____________。
[解析] (1)①表示以RNA為模板逆轉錄形成DNA的過程，所需原料為DNA的單體：4種脫氧核苷酸。過程③構建基因表達載體的過程需要用同種限制酶切割目的基因與運載體，用相同的DNA連接酶連接目的基因與運載體的末端。
(2)PCR技術中的變性是利用高溫使DNA發(fā)生變性，解旋形成單鏈。
(3)過程④將目的基因導入植物體細胞的方法常用農(nóng)桿菌轉化法，過程⑤受體細胞通過植物組織培養(yǎng)技術得到再生植株。
(4)過程⑥從再生植株中篩選成功轉基因的抗TMV煙草植株還需要進行基因工程操作步驟中
11、的目的基因的檢測與鑒定；其中，若從個體水平鑒定獲得的煙草能否抗TMV，可通過接種煙草花葉病毒的方法來確定。
[答案] (1)逆轉錄 四種脫氧核苷酸 限制酶和DNA連接酶 (2)使DNA解旋為單鏈(DNA解旋) (3)農(nóng)桿菌轉化法 植物組織培養(yǎng) (4)目的基因的檢測與鑒定 用TMV感染煙草，觀察煙草是否被感染(患病)
4．國際水稻研究所人員從產(chǎn)量低的耐淹水稻中找到一種耐淹基因，將其移入到高產(chǎn)熱帶水稻中，終于培育出耐淹的高產(chǎn)水稻品系，其產(chǎn)量比高產(chǎn)熱帶水稻產(chǎn)量還要高。耐淹基因移入的方法可通過轉基因技術實現(xiàn)。請回答下列相關問題：
(1)為培育耐淹的高產(chǎn)水稻品系，應需將耐淹基因進行體外擴增。在PC
12、R反應體系中加入了熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等，還加入耐淹基因作為________，加入__________________________________作為合成DNA的原料。
(2)質粒常被用作運載體，因為質粒具有__________________(答2點即可)。構建耐淹基因的質粒表達載體時，常用不同的限制酶對耐淹基因和質粒進行切割，目的是________________________________________________________。
(3)根據(jù)耐淹基因表達的蛋白質，研究人員通過對它的氨基酸序列設計并人工合成耐淹基因。與水稻的耐淹基因相比，人工合成的耐淹基因在結構上缺
13、少了__________________________________。雖然兩種基因轉錄的產(chǎn)物不同，但最終表達出相同的蛋白質，可能原因是_____________。
(4)蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不直接改造蛋白質的原因是____________。
[解析] (1)利用PCR技術在體外擴增耐淹基因(目的基因)時，在PCR反應體系中除了加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶、引物等外，還加入耐淹基因作為模板，加入dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)作為合成DNA的原料。
(2)質粒被用作運載體，應具備的條件有：能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定存在
14、；具有多個限制酶切位點，方便剪切；具有標記基因，便于檢測和篩選。構建耐淹基因的質粒表達載體時，用不同的限制酶對耐淹基因和質粒進行切割，可以減少耐淹基因及質粒的自身環(huán)化、使耐淹基因定向連接到質粒上，以增大耐淹基因正向(正確)連接的概率。
(3)根據(jù)耐淹基因表達的蛋白質的氨基酸序列推測出的mRNA分子中，缺乏與基因中的啟動子、終止子和內(nèi)含子相對應的堿基序列。由于密碼子具有簡并性，雖然兩種基因轉錄的產(chǎn)物不同，但最終能夠表達出相同的蛋白質。
(4)由于直接改造的蛋白質不能遺傳，而改造基因易于操作且改造后能夠遺傳，所以在蛋白質工程中，要對蛋白質結構進行設計改造，必須通過基因修飾或基因合成來完成，而不
15、直接改造蛋白質。
[答案] (1)模板 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) (2)能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定存在；具有多個限制酶切位點，方便剪切；具有標記基因，便于檢測和篩選(答2點即可) 減少耐淹基因及質粒的自身環(huán)化、增大耐淹基因正向(正確)連接的概率 (3)啟動子、終止子和內(nèi)含子 密碼子具有簡并性 (4)改造基因易于操作且改造后能夠遺傳
5．(2019·廣東省實驗中學高三聯(lián)考)CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術是近年來頗受關注的一項新技術。該基因表達系統(tǒng)主要包含引導RNA和Cas9蛋白兩個部分，引導RNA能識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結合到相應位置
16、并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。研究人員試圖用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻產(chǎn)量基因Q基因進行編輯，請回答下列問題：
(1)研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9僅存在于原核生物，故需借助________技術才能在水稻細胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與________酶的功能相似。
(2)首先依據(jù)________的部分序列設計DNA片段A(負責編碼相應引導RNA)，再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體(如圖所示)。位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示________酶切位點。
(3)質粒B大小為2.5 kb(位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60
17、 b)，經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5 kb(千堿基對)，連接形成的表達載體大小為________kb。
(4)常用農(nóng)桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，依據(jù)農(nóng)桿菌的侵染特點，目的基因將插入到Ti質粒的__________上，經(jīng)過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到________________________________，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。
(5)CRISRP/Cas9基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導RNA的角度分析脫靶的原因____________________________________。
[解析] (1)根據(jù)題干信息“Cas9蛋白結合到相
18、應位置并剪切DNA”，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。
(2)由于是對水稻產(chǎn)量基因Q基因進行編輯，故首先需要依據(jù)Q基因的部分序列設計DNA片段A(負責編碼相應引導RNA)，再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達載體(如圖所示)。根據(jù)片段A兩端的限制酶種類以及片段A連接在位點Ⅰ、位點Ⅱ之間，可知位點Ⅰ、位點Ⅱ分別表示KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點。
(3)質粒B大小為2.5kb(位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60 b)，經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5 kb(千堿基對)，連接形成的表達載體大小為2.5＋0.5－0.06＝2.94 (kb)。
19、(4)常用農(nóng)桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，由于農(nóng)桿菌的Ti質粒的T-DNA可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，經(jīng)過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到水稻細胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達。
(5)由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合，從而導致CRISRP/Cas9基因編輯技術會出現(xiàn)編輯對象出錯而造成脫靶。
[答案] (1)轉基因(DNA重組或基因工程) 限制 (2)Q基因 KpnⅠ、BamHⅠ (3)2.94 (4)T-DNA 水稻細胞染色體的DNA上 (5)其他DNA
20、序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合而脫靶
6．(2019·河南頂級名校高三聯(lián)考)為探究M基因的功能，科研人員將克隆得到的M基因導入擬南芥植株(自交繁殖)，流程圖如圖所示，回答下列問題：
(1)通過過程a、b，采用________法來獲得了大量的M基因，過程b中需先加熱至90～95 ℃然后冷卻至55～60 ℃，冷卻的目的是__________________________________________________________________。
(2)為了獲得轉基因植物，采用________法侵染擬南芥的花序。基本過程如下：
①過程d：將重組質粒導
21、入大腸桿菌，其目的是____________。
②過程e：將重組質粒導入農(nóng)桿菌，再將含有重組質粒的農(nóng)桿菌離心、富集，得到含有M基因的農(nóng)桿菌液。
③過程f：在擬南芥植株產(chǎn)生大量花序時，將其花表面部分在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡20～30 s，3～4周后對轉化擬南芥植株收種子(T0)，浸泡之前，需先剪去已經(jīng)長成的角果(這些角果將來發(fā)育成種子)，原因是_______________________。
④將收獲的擬南芥種子T0，播種在含有________的培養(yǎng)基上，能健康生長的幼苗含有____________。
(3)采用農(nóng)桿菌花序侵染的方法轉化，一般只能將目標片段整合到一條DNA上，若要獲得M基因穩(wěn)
22、定的突變體，需______________篩選出能穩(wěn)定遺傳的突變體。
[解析] (1)圖示中由已知RNA獲取目的基因的方法是反轉錄法(逆轉錄法)，對目的基因進行擴增采用的是PCR技術。進行PCR時需加熱至90～95 ℃然后冷卻至55～60 ℃，冷卻的目的是使引物結合到互補DNA鏈上。
(2)圖示中將基因表達載體構建完成后沒有直接導入農(nóng)桿菌，而是先將其導入大腸桿菌，目的是利用大腸桿菌的增殖來獲取大量重組質粒(讓目的基因擴增)。
適合轉化植株的花卉應沒有成熟，也沒有產(chǎn)生已受精的角果。因為這些已受精的角果將來結的種子肯定是非轉基因的，如果不剪掉的話會降低轉化率，不利于后續(xù)操作。
由于質粒中含
23、有卡那霉素抗性基因，成功轉入重組質粒的種子能夠在卡那霉素培養(yǎng)基上正常生長，非轉基因種子不能正常生長，一般萌發(fā)后死亡。
(3)由于農(nóng)桿菌介導的花序侵染法一般只能將目標片段整合到一條DNA單鏈上，為篩選出能穩(wěn)定遺傳的突變體，可將T0代連續(xù)自交。
[答案] (1)反轉錄法(或逆轉錄法)和PCR 使引物結合到互補DNA鏈上 (2)農(nóng)桿菌轉化?、佾@取大量重組質粒(讓目的基因擴增)?、圻@些已受精的角果將來結的種子是非轉基因的?、芸敲顾亍(目的)基因
(3)T0代連續(xù)自交
7．(2019·廣東省高三模擬)人參是珍貴的藥用植物，研究人員運用轉基因技術構建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人參細胞
24、表達系統(tǒng)，為珍貴藥用植物與疫苗聯(lián)合應用開辟了新思路，其構建過程如圖所示，圖中SmaⅠ、SstⅠ、 EcoRV為限制酶。請回答相關問題：
(1)②的構建過程除限制酶外還需要________酶；想要從②中重新獲得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoR Ⅴ或SmaⅠ，原因是__________________________________________。
(2)將重組質粒轉入農(nóng)桿菌常用________處理細胞；要使目的基因成功整合到人參細胞的染色體上，該過程所采用的質粒應含有____________。
(3)分析圖可知，②中應含有的標記基因是________；過程⑤的目的是____
25、__________________________。
(4)研究人員將HBsAg基因表達蛋白上的某位點氨基酸進行替換，通過一定的方法獲得了新HBsAg基因，進而獲得了免疫效應更強的疫苗，請按照蛋白質工程的原理寫出獲得新HBsAg基因的基本途徑_______________。
[解析] (1)圖中②為重組質粒，其形成時需要限制酶和DNA連接酶的參與；據(jù)圖分析可知，EcoR V、SmaⅠ切割后得到的是平末端，然后用DNA連接酶連接后，所形成的重組序列不能再被EcoR V和SmaⅠ識別，因此想要從②中重新獲得HBsAg基因，所用的限制酶不能是EcoRV或SmaⅠ。
(2)將目的基因導入農(nóng)桿菌
26、等微生物的方法是用鈣離子處理細胞；農(nóng)桿菌的質粒中含有一段可以轉移的DNA，即T-DNA，它能將目的基因成功整合到人參細胞的染色體上。
(3)⑤過程中是將受體細胞放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選出含有HBsAg基因的人參細胞，因此②中應含有的標記基因是氨芐青霉素抗性基因。
(4)據(jù)題意可知，按照蛋白質工程設計實驗的過程為從HBsAg基因表達蛋白的功能出發(fā)→設計HBsAg基因表達蛋白的結構→將HBsAg基因表達蛋白上的某位點氨基酸進行替換→找到并改造HBsAg基因的脫氧核苷酸序列。
[答案] (1)DNA連接 兩平末端連接后的重組序列不能再被EcoR V和SmaⅠ識別(重組質粒無這種限
27、制酶的識別序列) (2)鈣離子(Ca2＋) T-DNA (3)氨芐青霉素抗性基因 篩選出含有HBsAg基因的人參細胞
(4)從HBsAg基因表達蛋白的功能出發(fā)→設計HBsAg基因表達蛋白的結構→將HBsAg基因表達蛋白上的某位點氨基酸進行替換→找到并改造HBsAg基因的脫氧核苷酸序列
8．(2019·濮陽市高三二模)P450是石油降解的關鍵酶，用SalⅠ和NdeⅠ聯(lián)合酶切獲得的P450基因，與如圖所示的質粒(pCom8)重組，導入土著菌種Y9，獲得了基因工程菌P450/Y9。圖中mel是黑色素合成基因，其表達能使白色的菌落變成黑色，aacCl是慶大霉素(一種抗生素)抗性基因，限制酶NdeⅠ
28、、XhoⅠ和SspⅠ在原質粒上均只有一個酶切位點。如圖表示幾種限制酶的識別序列和切割位點，據(jù)圖回答下列問題：
(1)構建pCom8重組質粒時，需用________________________(限制酶)對圖示質粒進行處理，才能與________________在DNA連接酶的作用下形成重組質粒。
(2)為了擴增重組質粒，需將其轉入用________預先處理的土著菌種Y9中，提高質粒導入率，以便獲得更多基因工程菌P450/Y9。為了篩選出轉入了重組質粒的基因工程菌P450/Y9，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________作為載體的質粒除了含有標記基因，還應該含有_____________
29、_(至少寫兩個)。
(3)為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可觀測的指標是________________________________________。土著菌種Y9不能降解石油，但轉入上述構建好的表達載體后則獲得降解石油的能力，這是因為__________________________________________。
[解析] (1)根據(jù)題干信息已知，切割目的基因的限制酶是SalⅠ和NdeⅠ，而pCom8上無SalⅠ的切割位點，又因為如圖顯示SalⅠ和XhoⅠ切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用NdeⅠ、XhoⅠ切割質粒，然后與目的基因在DNA連接酶的作用下形成重組質粒。
30、(2)為提高質粒導入率，土著菌種Y9預先需用Ca2＋處理。因為XhoⅠ切割質粒會破壞標記基因mel，而aacCl未破壞，因此為了篩選出轉入了基因工程菌P450/Y9，應在篩選培養(yǎng)基中加入慶大霉素。質粒具備的特點有：含有標記基因、啟動子、終止子、復制原點、自我復制等。
(3)為檢測基因工程菌降解石油能力的大小，可在一定時間內(nèi)觀測所取樣品石油的剩余量。P450是石油降解的關鍵酶，轉入表達載體后，P450基因得以表達，即基因工程菌P450/Y9可分泌降解石油的P450酶。
[答案] (1)NdeⅠ、XhoⅠ 目的基因(或P450基因)
(2)Ca2＋(或CaCl2) 慶大霉素 啟動子、終止子、復制原點(答出兩點即可)
(3)2天后(或一定時間后)樣品中石油的含量(剩余量) 基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶(答案合理即可)
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2021版高考生物一輪復習 課后限時集訓40 基因工程 蘇教版
